*All tables, charts, graphs and pictures that are featured in this article can be found in the .pdf attachment at the end of the paper.
Žijeme v modernej dobe laboratórnej, v dobe, ktorá nám otvára možnosti vstupovať stále hlbšie do sveta molekúl, produkovať v krátkom čase a na malom priestore obrovské množstvo dát. V laboratórnej diagnostike v posledných desaťročiach zaznamenávame výrazný posun k automatizácii vyšetrovacích procesov, minimalizácii zariadení a počítačom asistovanej analýze. Tento stav je výsledkom snaženia mnohých známych výskumníkov aj bezmenných členov vývojových tímov.
Švajčiarsky lekár, Friedrich Miescher , v roku 1869 prvý krát izoloval DNA. Nádejal sa , že objaví fundamentálne princípy života a chemickú podstatu buniek. Spočiatku experimentoval s analýzou chemických látok (prevažne proteínov, ako hlavnej zložky cytoplazmy) z leukocytov získaných z hnisavých obväzov. Zdokonaľovaním pokusov sa mu podarilo zistiť, že dokáže z roztoku pridaním kyseliny precipitovať dovtedy nepoznanú substanciu, opäť rozpustnú po pridaní alkalickej látky. Zaznamenal, že táto substancia je bohatá na fosfor a vzhľadom na jej lokalizáciu v bunke ju nazval nukleín. V roku 1889 ju jeho žiak Richard Altman na podklade jej chemických vlastností premenoval na nukleovú kyselinu (NK).(1,2)
Napriek nerozpoznanému významu nukleových kyselín sa v nasledujúcich rokoch o ne zvýšil záujem, zdokonaľovali sa izolačné a purifikačné techniky, ale až v roku 1935 sa ruskému vedcovi Andrejovi Nikolajevičovi Belozerskému podarilo izolovať čistú DNA, čím sa definitívne otvorila brána k poznaniu jej štruktúry a funkcie v organizme. Poznanie chemickej a fyzikálnej povahy nukleových kyselín znamenalo ďalší rozvoj izolačných techník. (3).
Môžeme konštatovať, že všetky historické metódy pretrvávajú, aj keď v upravenej podobe do súčasnosti. V roku 1958, v čase experimentov Meselsona a Stahla (dokázali semikonzervatívnosť DNA) sa na extrahovanie DNA využívala hustotná gradientová centrifugácia, ktorá je v špeciálnych prípadoch a rôznych úpravách využívaná dodnes Na izoláciu nukleových kyselín sa najčastejšie zaužívali dva prístupy – prvý (aj historicky), založený na roztokoch a druhý, založený na kolónkach (nosičoch). Výber vhodného protokolu podlieha predovšetkým potrebe množstva, kvality a druhu finálnej nukleovej kyseliny, ale aj kvantitatívnym, priestorovým, časový a finančným pomerom. ( 4).
Prvým krokom úspešnej izolácie NK je lýza buniek. Jej cieľom je uvoľniť obsah bunky (resp. organel) pomocou jemných detergentov, prípadne ultrazvukom. Aby sa zabránilo degradácii cieľových molekúl, rozpad bunky prebieha v tlmivom roztoku a vhodných teplotných podmienkach. Na oddelenie cieľovej NK z roztoku bunkového obsahu sa využíva dočasná denaturácia – teplotná, vysoľovacia metóda alebo zrážanie organickými rozpúšťadlami. Kontamináciu DNA zvyškami RNA je možné jednoducho odstrániť pridaním enzýmu ribonukleázy.
Medzi jednoduchšie a historicky pôvodnejšie extrakčné prístupy patrí vysoľovacia metóda, založená na princípe zmeny rozpustnosti molekúl DNA v závislosti na zmene koncentrácie iónov v roztoku (najčastejšie síranu amónneho). Ďalšou jednoduchou možnosťou je zrážanie organickými rozpúšťadlami (etanol, polyethylenglykol), ktoré sa uskutočňuje na základe ich schopnosti znížiť rozpustnosť NK (zvýšením intramolekulovej elektrostatickej interakcie). Rôzna rozpustnosť DNA sa využíva aj pri fenol-chloroformovej extrakcii. Jej podstatou je oddelenie vodnej fázy (s DNA) od roztoku obsahujúceho fenol a chloroform pomocou vysokootáčkovej centrifugácie, s následnou etanolovou precipitáciou DNA. Aj keď je táto metóda časovo náročná a závislá na kvalite prevedenia, je stále pomerne často využívaná pre jej finančnú nenáročnosť a vyššie výťažky DNA. (4)
Metóda RESIN (z angl.; živica) využíva viazanie a následné uvoľnenie požadovanej substancie pomocou výmeny iónov medzi pevnou fázou a kvapalinou obklopujúcou pevnú fázu. Je to pomerne stará metóda (Thomas a Way, 1906), spočiatku využívaná v anorganickej chémii. Pôvodné prírodné materiály – sulfónované uhlie a zeolit, boli v polovici minulého storočia nahradené organickými iónomeničmi, ktoré sa používajú až do súčasnosti (aj v podobe komerčne dostupných kitov). Je to pomerne rýchla metóda s vysokým výťažkom a čistotou DNA. (4,5)
Metóda SILIKA matrice je tiež pomerne stará, aj pri nej nahradil prírodný materiál- diatomit (rozsievková zemina), synteticky pripravený silikagél. Silika materiál (SiO2) v prítomnosti chaotropných solí (jodod sodný, guanidin thiokyanát) adsorbuje DNA na svoj povrch, z ktorého je po opakovanom prečistení uvoľnená pomocou elučného činidla. Je to časovo nenáročná metóda s vysokou čistotou DNA a je tiež dostupná vo forme kitov.(4)
Najmladšie metódy izolácie využívajú magnetické mikročastice alebo nanočastice. Majú jadro, tvorené magnetickými oxidmi železa, obalené látkou (organické polyméry, silika) umožňujúcou naviazanie cieľových objektov, napríklad NK . Princípom je separácia takýchto magnetických partikúl pôsobením silného magnetu, ich následné premývanie a uvoľnenie NK z komplexu. Aj v tomto prípade je dostupných niekoľko kitov, ktoré umožňujú v pomerne krátkom čase získať DNA nekontaminovanú proteínmi alebo RNA. Keďže táto metóda nevyžaduje manipuláciu so škodlivými organickými rozpúšťadlami, opakovanú centrifugáciu, filtráciu vo vákuu alebo kolónkovú separáciu , je ideálna na automatizovanú separáciu. Izolačné automaty zabezpečia v krátkom čase a štandardných podmienkach spravidla väčšie množstvo vzoriek, preto sú ideálne v rutinných aj výskumných laboratóriách. Ich nevýhodou je finančná náročnosť (inštrument, špeciálne plasty, kity). (4,6)
Automatizácia laboratórií je nepochybne prínosom; redukuje pracovný čas i personálne zdroje , zvyšuje kvalitu a reproducibilitu výsledkov. V dnešnej dobe je nevyhnutné pokračovať v tomto trende. Nesmieme však podľahnúť pohodlnému tlaku automatov. Naše mysle nech sú rovnako otvorené, ako mysle bádateľov, ktorí pre nás dobu laboratórnu otvorili.
- Maderspacher F. Rags before the riches: Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Biol. 2004;14(15):R608
- Wolf Friedrich Miescher, the man who discovered DNA. Chemical Heritage. 2003;21(10-11): 37-41
- 1900 – 1953 – Converging on DNA. http://www.accessexcellence.org/RC/AB/BC/1900-1953.php
- Tan SC, Yiap BC. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Biomed. Biotechnol. 2009:1-10
- McGarvey FX. Introduction to industrial ion Exchange. Sybron Chemicals Inc., Birmingham, New Jersey; 1983
- Húska D, Baloun J, Trnková L, et al. Využití paramagnetických částic pro izolaci mRNA. CHEMagazín. 2008;18(3):14-15
