*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom 
PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Mnohopočetý myelóm  (MM) patrí  medzi  hematoonkologické  ochorenia plazmatických B-buniek. Vo väčšine prípadov prevláda výskyt nádorových buniek typu zrelých plazmocytov s nízkou proliferačnou aktivitou. Lokalizácia uvedených patologických foriem je striktne viazaná na mikroprostredie kostnej drene, kde prebieha ich proliferácia a diferenciácia(1). MM sa radí do skupiny  monoklonálnych gamapatií, pretože jedným z jeho základných znakov  je produkcia monoklonálnych protilátok. Za fyziologických podmienok sa v sére  zdravého  jedinca vyskytujú  polyklonálne imunoglobulíny,  ktoré sú  schopné podliehať rekombináciám a vytvárať tak široké spektrum väzbových miest pre rôzne  antigény. Pri monoklonálnych gamapatiách vrátane MM dochádza v organizme k produkcii  jedného antigénne i štruktúrne konzistentného antigénu, prípadne jeho  fragmentu, čím  je značne znížená efektivita  imunitného systému. Monoklonálne imunoglobulíny postupne infiltrujú kostnú dreň, kde nahrádzajú funkčné plazmocyty(2).

Patogenéza MM

MM prebieha ako  viacúrovňový proces, ktorý sa začína ako premalígne štádium, resp.  monoklonálna gamapatia nejasného významu  (MGUS) s variabilnou dĺžkou  trvania.  Od plne rozvinutého patologického stavu  sa líši nižšou hodnotou  paraproteínu M, kostná dreň  obsahuje menej  ako  10 % mononukleárnych buniek  a nie sú  prítomné ďalšie  symptómy a poškodenia orgánov(3). „Smoldering“ myelóm (SMM) je heterogénna prechodná forma  medzi  MGUS a plne rozvinutým ochorením. Odlíšenie  SMM a MGUS je možné len na základe hodnotenia laboratórnych výsledkov. Hlavným diferenciačným faktorom je prítomnosť vyššej hladiny paraproteínu (nad 30 g/l) a plazmatických buniek (nad 10 %) v kostnej dreni, ale  zároveň nesmú byť u pacienta prítomné žiadne ďalšie príznaky  ako hyperkalciémia, poškodenie obličiek alebo anémia(4). Dôsledkom progresie nádorovej masy je tiež potlačenie  hostiteľskej imunity, preto  počas transformácie SMM na  myelóm  dochádza k vzniku prídavných deficiencií celulárnych  aj humorálnych zložiek  imunity.  Nastáva postupné zhoršenie orgánových funkcií s možnosťou rozšírenia tumorových buniek  do extramedulárnych oblastí,  najčastejšie do pečene a sleziny(5).

Molekulová cytogenetika MM

Ako primárne mutácie sa pri MM označujú translokácie zahŕňajúce lokus  pre ťažký (IgH) imunoglobulínový reťazec alebo  jeden z lokusov pre ľahký Ig reťazec (IgL – kappa/lambda).

Uvedené mutácie sú prítomné u viac ako polovice pacientov. Vznikajú ako dôsledok nesprávnej „crosswitch“ rekombinácie  a somatickej hypermutácie protilátok. IgH translokácie zahŕňajú pri MM tri cieľové skupiny onkogénov, uvedené v tabuľke 1. Zvyčajne ide o vyvážené translokácie, počas ktorých sa onkogény dostanú pod kontrolu silného  Ig intrónového enhaceru Emu a/alebo IgH alfa(6).  V rámci sekundárnych aberácií dochádza pri MM najčastejšie k mutáciám zahŕňajúcim chromozómy 1, 13, 17 a výnimkou nie sú ani translokácie chromozómov 4, 11 a 14. Tumory plazmatických buniek s t(11;14)(q13;q32) sú  pri MM a MGUS asociované s nadprodukciou cyklínu D1 (CCND1), ale paradoxne sú pri zavedení vhodnej liečby spojené s dlhším prežívaním pacientov(7).

Waldenströmova makroglobulinémia  a gén MYD88

Waldenströmova makroglobulinémia (WM) je lymfoproliferatívne  ochorenie B-lymfocytov a zároveň jeden z podtypov non-Hodgkinových lymfómov. Primárnou črtou je infiltrácia kostnej drene  patologickými plazmocytárnymi bunkami a prítomnosť Ig monoklonálnej gamapatie. K najčastejším sprievodným javom patrí  anémia, hyperviskózny syndróm, hepatosplenomegália či lymfadenopatie. Histologická transformácia buniek  býva príčinou  progresie ochorenia do štádia difúznej B-bunkovej leukémie (DLBCL), keď dochádza ku komplexnému zhoršeniu symptómov s extramedulárnym postihnutím(8). Kandidátnym génom pri WM je MYD88 (myeloid differentiation primary response 88) lokalizovaný  na chromozóme 3p22. Kóduje 31 – 33 kDa adaptorový proteín, ktorý obsahuje N-terminálnu „death“ doménu (DD) a C-terminálnu TIR doménu (Toll/interleukin-1 receptor). Funkciou  proteínu je ukotvenie signálnych molekúl  na TIR doménu a na receptory pre interferón-γ (IFN-γ) na zabezpečenie správneho fungovania vrodených imunitných reakcií. Deregulácia génu MYD88 má v prevažnej väčšine prípadov negatívny dôsledok na signálne dráhy NF-κB, PI3K/Akt/mTOR či JAK/STAT(9).

Somatická  mutácia L265P

Somatický variant (T→C) v chromozómovej oblasti 3p22.2 je jednoznačným diagnostickým markerom WM. Mutácia zapríčiňuje aminokyselinovú zámenu leucínu za prolín (L265P) v géne  MYD88, čoho  následkom je abnormálne vysoká  aktivita uvedených signálnych dráh.  Výsledkom komplexného patologického procesu je tak malígna proliferácia a supresia apoptózy B-lymfocytov(10,11).

Diferenciálna diagnostika monoklonálnych gamapatií

Potvrdenie diagnózy monoklonálnych gamapatií zahŕňa sériu  biochemických vyšetrení,  predovšetkým elektroforézu sérových bielkovín (SPEP) a elektroforézu bielkovín v moči (UPEP). Separácia na klasickej agaróze v kombinácii s imunofixáciou sa využíva ako  skríningová metóda na detekciu prítomnosti M-proteínu  a jeho  ťažkých  Ig reťazcov  a determináciu ľahkých  Ig  reťazcov. Pretože uvedené metódy sú relatívne  neinvazívne, je vhodné  vykonať ich u všetkých pacientov.  Pri UPEP je nevyhnutný 24-hodinový odber  moču, pretože množstvo M-proteínu  v ňom  je nepriamym meradlom rozsahu tumorovej masy(12). Metódy  fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH) sa rutinne využívajú na analýzu chromozómových aberácií, najčastejšie  t(11,14),  ktorá  priamo súvisí  so zvýšenou expresiou CCND1 a je typická  práve  pre MM. Významným  markerom monoklonálnych gamapatií sú tiež prestavby IgH lokusu a časté sú aj delécie 17p13  (TP53) a 13q14 (RB1). Na molekulovej úrovni možno potvrdiť prítomnosť  najfrekventovanejších genomických delécií  a  duplikácií metódou MLPA (multiple  ligation-dependent probe amplification). Využitím kvantitatívnej real-time  PCR možno sledovať  hladinu expresie CCND1, ktorá u pacientov koreluje s mierou  liečebnej odpovede.

Problémom v rutinnej praxi je skutočnosť, že výsledky uvedených laboratórnych testov sú pri WM a MM do  značnej miery rovnaké,  čo môže  viesť k nepresnej diagnostike daného ochorenia, a tým aj k podaniu nešpecifickej liečby. U pacientov  s MM sa využíva kombinácia cytostatík a kortikosteroidov, prípadne imunomodulačné látky. Medzi najnovšie liečivá z oblasti cielenej  terapie MM patrí  talidomid,  inhibítory VEGF (vascular endothelial growth factor) alebo  proteazómové inhibítory(13). U pacientov s WM je pomerne častý výskyt neuropatií a hemolytickej anémie. V danom prípade je prvou voľbou rituximab, ktorý zabezpečuje elimináciu  malígnych B-lymfocytov prezentujúcich povrchový  antigén CD20. Pri progresii ochorenia sa využíva trojkombinácia DRC (dexametazón, rituximab,  cyklofosfamid)(14). Pre  aplikáciu vhodného  liečebného algoritmu je teda  nevyhnutná spoľahlivá diferenciálna diagnostika, ktorou možno odlíšiť uvedené monoklonálne gamapatie na molekulovej úrovni.

Materiál a metodika

Vzorky

Do súboru pacientov s podozrením na  Waldenströmovu makroglobulinémiu boli zahrnuté vzorky kostnej drene  spracované na oddelení lekárskej genetiky  v Medirexe, a. s., v časovom rozmedzí od októbra 2015 do marca 2016. Súbor bol zostavený z 29 vzoriek. DNA na analýzy bola izolovaná kitom QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)  podľa priloženého protokolu. Koncentrácia a kvalita vzoriek bola meraná na Implen  nanofotometri (Implen GmbH, Munchen, Germany). Ako negatívne kontroly boli použité vzorky od pacientov  bez onkologických diagnóz.

Alelovo špecifická PCR (AS-PCR)

Pri optimalizácii  vhodnej  AS-PCR boli  použité  komerčne  dostupné primery  od firmy Sigma-Aldrich  pre wild-type a mutovaný typ alel. Reakčné mixy boli pripravené s viacerými druhmi  polymeráz vrátane Pfu Turbo Cx Hotstart, AmpliTaq Gold a Phu. Ideálny priebeh  reakcie bol dosiahnutý iba v prípade poslednej Phu polymerázy. Genomická DNA bola nariedená na 10 ng a teplotný  program bol nastavený podľa článku Varettoni  et al., 2013(12). Veľkosť získaných PCR produktov bola približne 300 bp.

Sekvenovanie a MLPA analýza

Získané PCR produkty  boli enzymaticky purifikované pomocou Exo Sap (Applied Biosystems, Foster City, USA), ktorý zo zmesi odstráni nezainkorporované primery a dNTP. Na prípravu sekvenačnej reakcie bol použitý BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) a na finálnu purifikáciu  DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen, Hilden, Germany)  so živicovými kolónkami. Vzorky sme sekvenovali na genetickom analyzátore ABI 3500  (Applied Biosystems, Foster City,  USA) a vyhodnotili pomocou softvéru SeqScape. Výsledky  sme overili vložením  sekvencií  do BLAST-u a tiež pomocou MLPA analýzy (MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands). Použitý  probemix SALA MLPA P038  B1 obsahuje 51 špecifických prób pre B-bunkové aberácie vrátane somatickej mutácie L265P v géne  MYD88.

Výsledky

Kombináciou komerčne dostupných primerov, Phu polymerázy a protokolu podľa Varettoni  et al., 2013 sme zostavili  vhodnú  AS-PCR, ktorej  produkty  možno použiť na ďalšie  sekvenovanie  a  detekciu mutácie v géne   MYD88. V našom súbore analyzovaných pacientov sme pozitivitu výsledkov  hodnotili  na základe zámeny tymínu  za cytozín  na 978  nukleotide (obrázok  1). Získané výsledky sme potvrdili aj MLPA analýzou (obrázok 2). Uvedenými metódami sa nám podarilo  zostaviť  diagnostický algoritmus vhodný na detekciu pacientov s WM a odlíšiť ich tak od ostatných prípadov MM či iných monoklonálnych gamapatií. Počas analýzy pacientov  sme detegovali aj ďalších  11 polymorfizmov v géne MYD88, ktoré však nemali žiadny fenotypový prejav.

Diskusia

Waldenströmova makroglobulinémia rovnako  ako myelóm patrí medzi lymfoproliferatívne ochorenia B-buniek s výskytom monoklonálnych protilátok. Keďže je pomerne ťažké odlíšiť MM od WM na základe klinického obrazu a výsledkov laboratórnych testov, bolo naším cieľom zaviesť  do rutinnej diagnostiky molekulovú metódu, ktorá by spoľahlivo  identifikovala konkrétny  typ ochorenia. Publikácie z posledných rokov uvádzajú somatickú mutáciu L265P v géne  MYD88 ako diagnostický marker  jedinečný pre WM, pretože pri MM sa nenachádza. WM je relatívne zriedkavé ochorenie v rámci hematoonkologických malignít. Globálne je zaznamenaných približne 5 pacientov na 1 milión prípadov. Počas diagnostiky nových pacientov sme zaznamenali častý výskyt bodových polymorfizmov, najmä  2856 A > R. Vo väčšine prípadov  však išlo o silent  mutácie a v žiadnom z prípadov  sme nedetegovali fenotypový prejav.

Záver

Molekulové  metódy majú  v laboratórnej praxi nezastupiteľný význam, pretože prispievajú k presnej a relatívne  rýchlej diagnostike mnohých ochorení. Pomocou vhodne  zvoleného algoritmu je možný spoľahlivý manažment pacientov či samotné sledovanie liečebnej odpovede.

Poďakovanie

Tento článok vznikol vďaka podpore projektu VEGA 1/0906/

Literatúra
1. Boyle EM, Davies FE, Leleu X, et al. Understanding the multiple biological
aspect leading to myeloma. Haematologica 2014; 99(4): 605- 612.
2. Matsui W, Wang Q, Barber JP, et al. Clonogenic Multiple Myeloma Progenitors,
Stem Cell Properties, and Drug Resistance. Cancer Res 2008;
68(1): 190-197.
3. Chesi M, Bergsagel PL. Molecular pathogenesis of multiple myeloma:
basic and clinical updates. Int J Hematol 2013; 97: 313-323.
4. Korde N, Kristinsson SY, Landgren O. Monoclonal gammopathy of
undetermined significance (MGUS) and smoldering multiple myeloma
(SMM): novel biological insights and development of early treatment
strategies. Blood 2011; 117(21): 5573-5581.
5. Kristinsson SY, Goldin LR, Björkholm M, et al. Genetic and immune-related
factors in the pathogenesis of lymphoproliferative and plasma cell
malignancies. Haematologica, 2009 94: 1581-1589.
6. Chesi M, Bergsagel PL. Many Multiple Myelomas: Making More of the
Molecular Mayhem. Hematology 2011; 344-353.
7. Raab MS, Podar K, Breitkreutz I, et al. Multiple myeloma. Lancet 2009;
374: 324-329.
8. Braggio E, Philipsborn C, Novak A, et al. Molecular Pathogenesis
of Waldenström’s Macroglobulinemia. Haematologica 2012; 97(9):
1281-1290.
9. Olson A, Lee MS, Kissner TL, et al. Discovery of Small Molecule Inhibitors
of MyD88-Dependent Signaling Pathways Using a Computational
Screen. 2015; Online Available: www.nature.com/scientificreports.
10. Treon SP, Hunter ZR. A New Era for Waldenstrom Macroglobulinemia:
MYD88 L265P. Blood 2013; 121(22): 4434-4436.
11. Hamadeh F, MacNamara SP, Aguilera NS, et al. MYD88 L265P mutation
analysis helps define nodal lymphoplasmacytic lymphoma. Modern
Pathology 2015; 28: 564-574.
12. Molle P. Current Trends in the Diagnosis, Therapy and Monitoring of
the Monoclonal Gammopathies. Clin Biochem Rev 2009; 30: 93-103.
13. Špička I, Bartúnková J, Campr V, et al. Mnohopočetný myelóm a další
monoklonální gamapatie. Praha: Galén 2005. 125p.
14. Ansell SM, Kyle RA, Reeder CB, et al. Diagnosis and Management of
Waldenström Macroglobulinemia: Mayo Stratification of Macroglobulinemia
and Risk-Adapted Therapy (mSMART) Guidelines, Mayo Clin Proc
2010; 85(9): 824-833.
15. Varettoni M, Arcaini L, Zibellini S, et al. Prevalence and Clinical Significance
of the MYD88 (L265P) Somatic Mutation in Waldenström’s Macroglobulinemia
and Related Lymhoid Neoplasms. Blood 2013; 121(13):
2522-2528.