*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.
Úvod
Krátke tandemové repetície (STR – z angl. short tandem repeats)/mikrosatelity patria medzi najrýchlejšie mutujúce oblasti v ľudskom genóme a sú zdrojom genetickej variácie, ktorá bola historicky dlhodobo podceňovaná. Dnes je už všeobecne známe, že sa spájajú s množstvom dobre opísaných fenotypov a patologických stavov(1,2) . Somatická STR variabilita nazývaná aj mikrosatelitová instabilita (MSI), je charakteristickým znakom niektorých onkologických ochorení. Je definovaná ako zmena v dĺžke STR motívov (typicky
tvorených 2 – 6 nukleotidovými opakovaniami zoradenými niekoľkokrát za sebou)(3) . STR lokusy zvyknú akumulovať indely (inzercie a delécie nukleotidov v menšom rozsahu) viacerých bázových párov v dôsledku zlyhania opravného mismatch repair (MMR) mechanizmu(4) . MSI sa vyskytuje zhruba v 10 – 15 % kolorektálnych, gastrických a endometriálnych karcinómov a menej často v iných solídnych nádoroch. Tento fenotyp replikačnej chyby je považovaný za poznávacie znamenie dedičného predispozičného nádorového ochorenia, Lynchovho syndrómu (LS)(5) . Nádory sú klasifikované na základe proporcie nestabilných STR motívov do troch tried: MSI-H tumory a MSI-L tumory (podľa podielu instabilných motívov) a mikrosatelitovo stabilné tumory (MSS) bez detegovateľnej instability v analyzovaných STR motívoch. V súčasnosti sa objavuje konsenzus postačujúcej binárnej klasifikácie: MSI a MSS(6) , vzhľadom na podobnosť klinických aspektov medzi MSI-L a MSS malignitami(7) . Pacienti s nádormi s preukázanou MSI majú v porovnaní s MSS lepšiu prognózu v skorých štádiách ochorenia a znížený benefit z adjuvantnej chemoterapie na báze 5-fluorouracilu v II. a III. štádiu(8) . Naopak, MSI predstavuje jeden z hlavných prediktorov odpovede pacienta na inovatívne protinádorové terapie prostredníctvom inhibície imunitných kontrolných bodov(9) .
Metódy detekcie MSI na báze tekutej biopsie
Konvenčné metódy detekcie prítomnosti MSI ako imunohistochémia (IHC) a MSI-PCR sú stále najrozšírenejšími diagnostickými a skríningovými postupmi. Informačný potenciál reflektujúci variabilitu v STR motívoch je však v tomto prípade limitovaný dostupnosťou nádorového aj referenčného kontrolného tkaniva. Ich aplikácia je preto možná iba v prípade už diagnostikovaných a chirurgicky dostupných nádorov. Konvenčné a rutinne používané invazívne metódy sú tak čoraz častejšie suplované o menej invazívne techniky s možnosťou využitia vysoko citlivého sekvenovania fragmentov cell-free DNA/cirkulujúcej tumorovej DNA (cfDNA/ ctDNA), extrahovaných z periférnej krvi. Ich benefit spočíva práve v detekcii MSI bez potreby predošlej znalosti o prítomnosti, lokalizácii a chirurgickej dostupnosti tumoru. Spoločným menovateľom štandardných diagnostických testov vyšetrujúcich MSI v onkológii je invazívnosť, nemožnosť opakovaného monitorovania, nedostupnosť alebo obťažnosť bioptického vyšetrenia pri niektorých formách tumorov s neadekvátnym nádorovým tkanivom alebo ťažko dostupnou lokalizáciou (10,11) a v neposlednom rade neschopnosť reflektovania intratumorovej heterogenity (obrázok 1). Medzi technické obmedzenia môžeme zaradiť aj možnosť falošne pozitívnych, repsektíve falošne negatívnych výsledkov IHC analýz, ktoré vznikajú pri polymorfizmoch v STR lokusoch(12) .
Z uvedených dôvodov sa čoraz väčší počet laboratórií snaží zaradiť analýzu ctDNA do programov rutinného MSI skríningu(13,14) . ctDNA obsahuje genomické alterácie, ktoré umožňujú prekonanie intratumorovej heterogenity a zachytenie MSI statusu na úrovni celého nádoru(15,16) . Bolo pozorované, že disperzia počtu nestabilných STR lokusov nepriamo koreluje s hustotou mutácií nadmerne zastúpených v aktívne transkribovaných oblastiach. Relatívna deplécia MSI v stabilných polohách nukleozómov tiež hovorí, že konfigurácia chromatínu je hlavným determinantom jej distribúcie(17) . Vysoká koncentrácia variability STR lokusov bola pozorovaná aj v regulačných génových oblastiach, ako sú promótory a enhancery, v aktívne transkribovaných oblastiach (euchromatín) a v rámci intergénových, intronických a 3’ neprekladaných oblastiach (3’ UTR), na rozdiel od neaktívneho konštitutívneho heterochromatínu(18) . Komplexná analýza MSI na úrovni celého genómu má zároveň potenciál transformovať biomedicínsky dosah STR variability nad rámec bežných vyšetrení, s výraznou pridanou hodnotou pre onkologického pacienta. V prospech posunu diagnostiky MSI z oblasti reaktívnych prístupov k proaktívnemu skríningu na báze celogenómového sekvenovania cirkulujúcich cfDNA/ctDNA hovoria štúdie preukazujúce vysokú mieru zhody v porovnaní s konvenčnou tkanivovou biopsiou(19,20) .
Potenciál využitia v manažmente pacientov(21,22) , ako aj testovanie MSI prostredníctvom ctDNA alebo cfDNA je stále v štádiu vývoja. Pred ich implementáciou je potrebné vyriešiť viaceré výzvy. Miľníkom, ktorý stojí v aktívnejšom introdukovaní nových prístupov priamo k pacientovi je absencia štandardizovaných procedúr, protokolov a postupov ohľadom odberu, prípravy, spracovania, uskladnenia a validácie vzoriek v dostupných štúdiách. Tieto metodologické aspekty dokážu signifikantne ovplyvniť následné analýzy cfDNA/ ctDNA a môžu viesť k biasom pri porovnávaní postupov naprieč štúdiami(23,24) . Napriek tomu, že tekutá biopsia môže byť diagnosticky spoľahlivou alternatívou s preukázateľne vysokou senzitivitou a špecificitou(19,20) , boli opísané aj niektoré jej limitácie(25) . Problémom sú najmä nádory s nízkou koncentráciou cirkulujúcich tumorových buniek a tiež tumory, ktoré uvoľňujú nízke koncentrácie fragmentov ctDNA do krvného obehu(26) .
Medzi dostupné testy využívajúce cfDNA patrí napríklad OncoLBx, vytvorený ako kombinácia jednomolekulového sekvenovania (SMSEQ) a panela, ktorý pozostáva zo 75 génov a 5 homopolymérnych markerov. Validačné testy preukázali, že OncoLBx dokáže detegovať variantné alely s frekvenciou ≥ 0,1 % pre SNV a indely, ≥ 0,5 % pre fúzie, ≥ 4,5 % pre CNV a ≥ 2 % pre MSI, pričom vykazuje špecifickosť ≥ 99,99 % pre všetky typy variantov(27) . Willis et al. demonštrovali robustnosť svojho prístupu pre detekciu MSI pomocou FDA schváleného testu Guardant360® CDx (Guardant Health, Redwood City, CA, USA). Preukázal vysokú citlivosť v porovnaní s metódami založenými na tkanivovej biopsii(19) . Sľubným sa zdá aj prístup pre paralelnú a neinvazívnu detekciu MSI a nádorovej mutačnej záťaže/nálože, ktorý je vysoko efektívny v predikcii protinádorovej odpovede na imunoterapiu. Vo validačných analýzach dosiahol 100 % senzitivitu a špecificitu na párových vzorkách nádorového a zdravého tkaniva(28) . Rovnaké hodnoty zaznamenal aj FoundationOne® Liquid CDx (Foundation Medicine, Cambridge, MA, USA)(29) .
Vzhľadom na vysokú mieru fragmentácie a nízku frakciu ctDNA v krvi (0,01 % v skorých štádiách rakoviny) spolu s technickými artefaktmi generovanými počas laboratórneho spracovania, sú potrebné robustné, validované a veľmi citlivé hodnotiace algoritmy a bioinformatické nástroje(26,29) . S využitím panela ColonCore a bioinformatického nástroja bMSISEA (blood MSI signature enrichment analysis) bola preukázaná testovacia senzitivita 94,1 % a špecificita 100 % s minimálnou frakciou ctDNA 0,4 %. Daný algoritmus je schopný užívateľovi poskytnúť výstup v podobe binárnej klasifikácie vzoriek na MSI, respektíve MSS(30) . Nástroj MSIsensor-ct (31) vychádzajúci z MPS dát cfDNA dosiahol 100 % koreláciu s konvenčnými prístupmi, a to už pri minimálnej frakcii ctDNA nad 0,05 % a hĺbkou pokrytia viac ako 3 000x. Pri týchto špecifikáciách je hodnotiaci nástroj MSIsensor-ct schopný spoľahlivej detekcie MSI. Skoré a včasné zachytenie MSI pomocou analýzy tekutej biopsie má tak široké klinické využitie počas celoživotného sledovania nielen pacientov s kolorektálnym karcinómom. Môže umožniť: (i) efektívnejší manažment pacientov s LS a ich asymptomatických príbuzných, ktorí majú zvýšené celoživotné riziko vzniku asociovaných malignít; (ii) lepšiu prognózu z hľadiska indikácie liečby pre pacientov s vysokou mierou instabilných STR lokusov; (iii) vynechanie fluorouracilovej, karboplatinovej, a cisplatinovej adjuvantnej chemoterapie u pacientov s diagnostikovanou MSI, a to z dôvodu preukázateľne nízkej odpovede tumoru na dané formy terapie(8) ; a (iv) predikciu účinnosti inovatívnych liečebných prístupov na báze imunoterapie, s cieľom identifikovať takých jedincov, pre ktorých môže byť takýto typ personalizovanej liečby prospešný(10) .
Zhrnutie
Analýza MSI pomocou tekutej biopsie a stratégie vychádzajúcich z MPS predstavuje na základe dostupných štúdií sľubný prístup nielen v skorej detekcii, prediktívnej diagnostike a cielenej prevencii, ale taktiež v manažmente protinádorovej terapie a následného monitorovania odpovede. Takýto skríning ponúka možnosti pacientom so zvýšeným rizikom vzniku ochorenia súvisiaceho s MSI aj bez rodinnej anamnézy alebo pacientom, ktorých nádorové tkanivo je nedostupné, prípadne môže byť jeho získanie kontraindikované. Vďaka prekonávaniu rôznych technologických a bioinformatických limitácií vychádzajúcich z podstaty repetitívnych STR motívov a cfDNA/ctDNA sú prístupy detekcie MSI čoraz bližšie k ich plnohodnotnej implementácii do rutinnej klinickej diagnostiky.
Poďakovanie
Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Centrum pre biomedicínsky výskum – BIOMEDIRES – II. etapa , kód ITMS: 313011W428, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
LITERATÚRA
1. Buglyó G, Styk J, Pös O, et al. Liquid Biopsy as a Source of Nucleic Acid Biomarkers in the Diagnosis and Management of Lynch Syndrome. Int J Mol Sci. 2022; 23. doi:10.3390/ijms23084284
2. Depienne C, Mandel J-L. 30 years of repeat expansion disorders: What have we learned and what are the remaining challenges? Am J Hum Genet. 2021; 108: 764-785.
3. Chambers GK, MacAvoy ES. Microsatellites: consensus and controversy. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2000; 126: 455-476.
4. Reyes GX, Schmidt TT, Kolodner RD, Hombauer H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 2015; 124: 443-462.
5. Buglyó G, Styk J, Pös O, et al. Liquid Biopsy as a Source of Nucleic Acid Biomarkers in the Diagnosis and Management of Lynch Syndrome. Int J Mol Sci. 2022; 23. doi: 10.3390/ijms23084284
6. Redford L, Alhilal G, Needham S, et al. A novel panel of short mononucleotide repeats linked to informative polymorphisms enabling effective high volume low cost discrimination between mismatch repair deficient and proficient tumours. PLoS One. 2018; 13: e0203052.
7. Phipps AI, Limburg PJ, Baron JA, et al. Association between molecular subtypes of colorectal cancer and patient survival. Gastroenterology. 2015; 148: 77-87.e2.
