Vyhodnotenie početnosti a pozitivity SARS-CoV-2 testovania na Slovensku v čase pandémie COVID-19 – výsledky laboratórií Medirex, a. s.

Abstrakt:

Pandémia ochorenia COVID-19 trvala na Slovensku od marca 2020, pričom trvá dodnes, ale intenzívne laboratórne testovanie sa ukončilo v októbri 2022, keď počty testov významne poklesli. Za celé toto obdobie bolo len v laboratóriách spoločnosti Medirex, a. s., ktoré vykonávali významnú časť diagnostických laboratórnych testov na Slovensku, spravených viac ako 1,3 milióna testov. Ich distribúcia z pohľadu počtu realizovaných testov, ako aj podiel pozitívnych prípadov sa líšil v závislosti od konkrétneho regiónu, pričom vieme, že počas pandémie sa lokálne ložiská správali z pohľadu premorenosti odlišne a práve s cieľom čo najpresnejšej identifikácie pozitívnych prípadov sa v danom regióne v danom čase zintenzívnilo testovanie. Práve charakterizácia a vizualizácia regionálnych rozdielov v týchto dvoch parametroch vychádzajúcich z testovania je náplňou tejto práce.

Kľúčové slová: SARS-CoV-2, COVID-19, pandémia, Slovensko, regionálna charakterizácia

*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Pandémia ochorenia COVID-19 zapríčinená vírusom SARS-CoV-2 vyústila do celosvetovej zdravotníckej krízy v dôsledku vysokej chorobnosti a úmrtnosti infikovaných. Súčasťou každodenného života obyvateľov Slovenska sa stala formálne 6. marca 2020, keď bol potvrdený prvý prípad infekcie SARS-CoV-2 u slovenského občana s cestovateľskou anamnézou(1) , pričom prvé protipandemické opatrenia boli prijaté takisto v tento deň(2) .

Prísne pravidlá a opatrenia prijaté na Slovensku na začiatku pandémie udržiavali počet nakazených relatívne pod kontrolou, letné mesiace dokonca priniesli aj dni s nulovým počtom PCR pozitívnych testov. Ďalšia vlna pandémie počas zimy 2020/2021 však priniesla výrazné zhoršenie situácie(3) . Toto zhoršenie bolo z veľkej miery zapríčinené aj rozšírením nového variantu alfa (B.1.1.7) do slovenskej populácie a dokonca presiahlo očakávania odborníkov krízového štábu(4) . Ako je však známe, koronavírusy majú vo všeobecnosti schopnosť vysokej frekvencie rekombinácie genómu vedúcej k nepredvídateľným zmenám ich virulencie(5) .

O variante alfa, ktorý bol prvýkrát detegovaný v Spojenom kráľovstve na jeseň v roku 2020, sa zistilo, že je o 43 – 90 % viac infekčný ako predtým existujúce varianty(6) . Zo 17 mutácií aminokyselín detegovaných v alfa variante sa predpokladalo, že mutácia N501Y môže urýchľovať prenos vírusu, pretože v doméne viažucej receptor spike proteínu zvyšuje väzbu na ľudské receptory enzýmu konvertujúceho angiotenzín 2(7) . Toto je tiež bežná mutácia nájdená v beta (8) a gama variante(9) . Na druhej strane, delta variant obsahuje mutáciu P681R v mieste štiepenia furínu v spike proteíne a mutáciu R203M v nukleokapsidovom proteíne, čo ďalej zvyšuje infekčnosť vírusu(10) . Delta variant je tiež spojený so zvýšenou závažnosťou ochorenia a s dlhšou prítomnosťou vírusu v organizme pacienta(11) .

Na Slovensku aj vo svete je diagnostika ochorenia COVID-19 najčastejšie vykonávaná detekciou nukleovej kyseliny SARS-CoV-2 vo vzorkách z nazofaryngeálnych výterov pomocou reverzne transkriptázovej kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (RT-qPCR)(12) . RT-qPCR zabezpečí prepis vírusovej RNA do cDNA a kvantifikuje sledovaný úsek z genómu vírusu v reálnom čase. Monitorovanie amplifikácie je založené na princípe fluorescencie pomocou sond, resp. prób (označkovaných fluorescenčnými látkami), ktoré sa špecificky alebo nešpecificky viažu na amplifikovanú DNA. Pre každú vyšetrovanú vzorku je na základe nameraných zmien fluorescenčných signálov vytvorená amplifikačná krivka(13) . Pre každú amplifikačnú krivku sa potom určí prahový cyklus, označovaný ako Ct (threshold cycle), čo je priesečník medzi amplifikačnou krivkou a hraničnou hodnotou, a určuje pozitivitu testu. Hodnota Ct predstavuje počet cyklov PCR potrebných na to, aby fluorescenčný signál generovaný inkorporáciou fluorescenčne označkovaných sond do PCR produktu prekročil úroveň fluorescencie pozadia v kontexte s hraničnou hodnotou(14) . I keď je hodnota Ct relatívna veličina, jej nízke hodnoty naznačujú vysokú vírusovú záťaž a potenciálne vysokú úroveň infekčnosti jedinca. Vysoké hodnoty Ct naznačujú veľmi skoré alebo neskoré štádium infekcie, a teda potenciálne nízku úroveň infekčnosti jedinca(15) . Neschopnosť predpovedať mieru zmeny infekčnosti SARS-CoV-2 bránia schopnosti efektívne reagovať na krízu nielen na Slovensku, ale aj vo svete. Pre efektívnejšie a udržateľnejšie riadenie pandémie je potrebné predvídať zlepšenie/zhoršenie epidemiologickej situácie a predchádzať jej zhoršeniu sledovaním súboru epidemiologických kritérií na regionálnej, národnej, ale aj medzinárodnej úrovni, aby boli opatrenia sprísňované a uvoľňované na základe objektívnych kritérií(16) . Cieľom práce bolo sumarizovať výsledky SARS-CoV-2 diagnostického testovania na Slovensku na regionálnej úrovni s rozsahom definovaným mierou realizovaných testov v laboratóriách Medirex, a. s., a s väzbou na priebeh pandémie hodnotenej na národnej úrovni.

Metódy

Štúdia analyzovala dáta poskytnuté akreditovaným laboratóriom Medirex. Údaje predstavujú výsledky RT-qPCR testov vzoriek pacientov a bežnej populácie vyhodnotené od marca 2020 do októbra 2022 v Centrálnom laboratóriu Bratislava, Košice a Nitra. Počas tohto obdobia laboratóriá zanalyzovali 1 384 368 testov. Vzorky boli prijaté zo 74 (93,7 %) okresov Slovenska. Sledovanie vývoja množstva a pozitivity testovaných vzoriek v jednotlivých regiónoch Slovenska si vyžadovalo určitú početnosť vzoriek, preto by použitie kategórií podľa okresov nebolo výpovedné, keďže v niektorých bol vyšetrený príliš malý počet vzoriek. Rozdelenie na kraje by však neukázalo územnú variabilitu v tých miestach, kde bol počet vzoriek dostatočný aj na sledovanie rozdielov medzi menšími územnými celkami. Preto boli na účel štatistiky vytvorené regióny pozostávajúce z rôznych počtov okresov podľa hustoty testovania, aby na území s väčšou hustotou mohli byť sledované aj rozdiely medzi menšími územnými celkami a zároveň aby na území s nízkou hustotou nevznikli regióny s extrémne nízkymi počtami vyšetrených vzoriek. Analyzované vzorky boli preto rozdelené do 17 regiónov a obdobie bolo rozdelené do 19 časových úsekov v 7-týždňových intervaloch.

Prítomnosť SARS-CoV-2 bola stanovená z nazofaryngeálnych a slinných výterov. Automatizovaná izolácia nukleovej kyseliny (RNA) na magnetických časticiach sa uskutočnila pomocou súprav Sera-Xtracta Virus/Pathogen Kit (Cytiva) a Zybio Nucleic Acid Extraction Kit (Zybio) s použitím systému KingFisher™ Flex Purification System (Thermo Scientific)/Zybio EXM 3000 Nucleic Acid Isolation System/Zybio EXM 6000 Nucleic Acid Isolation System (Zybio). Testovanie sa uskutočnilo metódou RT-qPCR s použitím súprav COVID-19 Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Labsystems Diagnostics)/SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Zybio)/ Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver) pomocou qPCR platforiem ABI 7500 (Fast) Real-Time PCR System (Applied Biosystems)/QuantStudio 5/QuantStudio 6 Real-Time PCR System (ThermoFisher). Údaje získané pre každý test zahŕňali denné číslo vzorky, dátum odberu, ID pacienta, vek, pohlavie, miesto odberu vzorky, výsledok testu a v prípade pozitívneho výsledku aj hodnotu Ct vírusového génu E – hraničná hodnota do 40 (pre kit SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Zybio))/41 (pre kity Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Labsystems Diagnostics), Real Time Multiplex RT-PCR Kit (Liferiver)) – t. j. sekvencia nukleovej kyseliny bola identifikovaná v čase, keď PCR prešla 39/40 cyklami.

Výsledky

Zaradenie okresných miest do 17 regiónov Slovenska je znázornené v tabuľke 1.
Grafické zobrazenie meniaceho sa počtu vykonaných testov v regiónoch Slovenska (regióny 1 – 17) v 7-týždňových intervaloch od marca 2020 do októbra 2022 (časové intervaly 1 – 19) je znázornené na obrázku 1. Najpočetnejšie zastúpenie vyhodnotených RT-qPCR testov mal počas celého analyzovaného obdobia región 1 (okresy Bratislava, Pezinok, Senec), a to 622 089 vyhodnotených RT-qPCR testov. Najvyšší počet testov bolo vyhodnotených v časovom intervale 03-022022 – 23-03-2022, a to 201 618 testov spolu vo všetkých 17 regiónoch Slovenska.

Podobné mapy s hodnotami pozitivity v regiónoch Slovenska (regióny 1 – 17) v 7-týždňových intervaloch od marca 2020 do októbra 2022 (časové intervaly 1 – 19) sú zobrazené na obrázku 2, farebná škála determinuje pozitivitu od 0 do 75 %. Najviac pozitívne vyhodnotených RT-qPCR testov mal počas celého analyzovaného obdobia región 1 (okresy Bratislava, Pezinok, Senec), a to 112 493 pozitívnych RT-qPCR testov, čo predstavuje viac ako 18 % pozitivitu zo všetkých vykonaných testov v regióne 1 počas analyzovaného obdobia. Najvyšší počet pozitívnych testov bolo zaznamenaných v časovom intervale 03-02-2022 – 23-032022, a to 122 282 testov spolu vo všetkých 17 regiónoch Slovenska, čo predstavuje pozitivitu takmer 35 % pre daný dátumový interval.

Diskusia

Vzorky pochádzajúce zo 74 okresných miest Slovenska boli na účely štúdie zlúčené a zaradené do 17 regiónov Slovenska z dôvodu čo najefektívnejšieho odseparovania okresov s extrémne nízkym počtom vykonaných RT-qPCR testov. Vďaka vytvoreniu 19 časových intervalov sme takisto predišli nízkemu zastúpeniu testov v určitých týždňoch nami skúmaného obdobia, a to najmä v mesiacoch prvého polroka od vypuknutia pandémie predstavujúcich prvú fázu zavádzania rutinného testovania, ktorá bola obdobím zefektívňovania procesov(17) .

Početnosť RT-qPCR testov vykonaných na Slovensku vo veľkej miere ovplyvňuje aj preplácanie testov poisťovňami. Veľká zmena nastala od mája 2022, odkedy na bezplatné vykonanie RT-qPCR testu nestačí, aby mal pacient príznaky ochorenia COVID-19, no je potrebné aj odporúčanie od lekára (všeobecného alebo špecialistu). Výnimkou sú pacienti nad 60 rokov, ktorí sa môžu aj naďalej hlásiť na testovanie prostredníctvom štátneho portálu pri príznakoch ochorenia(18) . Nižšia početnosť testov v regiónoch Slovenska v časovom intervale zahŕňajúcom prelom apríl/máj 2022 (obrázok 1P) je detegovaná aj v našej štúdii. Výrazne znížená početnosť testov je následne detegovaná od polovice mája 2022 až do konečného dátumu zanalyzovaných dát štúdie (obrázok 1R, 1S, 1T).

Pri detekcii regionálnej pozitivity sú na mapách v určitých časových intervaloch zobrazené aj sivé regióny, resp. regióny bez priradenej škály pozitivity – týmto spôsobom sú odseparované nereprezentatívne regióny s nízkym počtom vykonaných testov pre daný časový interval (menej ako 50 testov) (obrázok 2). Najvyššie percentuálne zastúpenie pozitivity bolo zaznamenané v regióne 8 (okresy Nové Mesto nad Váhom, Trenčín, Ilava, Púchov) v časovom intervale 30-06-2022 – 1708-2022, a to 75 % (obrázok 2S). Tento údaj je však zrejme nereprezentatívny, pretože v danom časovom intervale bol vyhodnotený nízky počet vzoriek (80 testov) a susedné regióny s vyšším počtom vykonaných testov podobnú pozitivitu nezaznamenali. Zároveň môže byť dôvodom stratégia testovania, keď sa v laboratóriách analyzovali prioritne vzorky zo zdravotníckych zariadení, prípadne zo zariadení sociálnych služieb, ak vzniklo podozrenie na lokálne šírenie v komunite, a v kombinácii s nízkym počtom testov získaných v danom regióne v danom časovom rozsahu to mohlo spôsobiť výskyt extrémnych hodnôt pozitivity.

Reprezentatívnym obdobím by však mohol byť časový interval 03-02-2022 – 23-03-2022, 7-týždňový interval s najvyšším počtom vyhodnotených testov, počas ktorého bola v regióne 4 (okresy Nové Zámky, Levice) detegovaná takmer 70 % pozitivita, pričom pozitivita všetkých susedných regiónov dosahovala takisto asi 65 % (obrázok 2O). Predpoveď šírenia pandémie na okresnej úrovni bola čiastočne riešená po zavedení tzv. COVID automatu – systému na monitorovanie vývoja epidémie a prijímania protiepidemických opatrení v závislosti od intenzity šírenia SARS-CoV-2 na Slovensku, ktorý nadobudol platnosť 8. februára 2021(19) . COVID automat zohľadňuje dynamiku ochorenia na území okresu. Zahŕňa viacero ukazovateľov a disponuje špecifickým algoritmom pre výpočet tzv. okresného skóre, na základe ktorého je okresu priradená farba (zelená predstavujúca monitoring – čierna predstavujúca 3. stupeň ohrozenia). S narastajúcim skóre vzrastá stupeň rizika a aplikované sú prísnejšie opatrenia. Susedné okresy sa nemôžu líšiť o viac ako 1 stupeň (farbu), okolité okresy konvergujú k farbe rizikovejšieho okresu, aby rozdiel medzi nimi bol maximálne 1 stupeň oproti kalkulovanej úrovni rizika. COVID automat sa zapína, keď Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) vyhlási pandémiu. Naopak, keď WHO vyhlási pandémiu za ukončenú, resp. keď ÚVZ vyhlási epidémiu na Slovensku za ukončenú, COVID automat sa vypne(20) . Štátny portál informuje o pozastavení COVID automatu ku dňu 25. 11. 2021, s odôvodnením priaznivej epidemiologickej situácie v čase jeho pozastavenia(21) . Naše dáta však preukazujú stúpajúci trend pozitivity v regiónoch Slovenska práve v časových intervaloch, keď bol COVID automat pozastavený a po jeho pozastavení. Pre budúcnosť by bolo možné práve dáta z výsledkov tejto našej práce zohľadniť pri tvorbe aktualizovanej podoby COVID automatu, ak by takáto potreba vznikla.

 

Poďakovanie
Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Výskum progresívnych metód diagnostiky COVID-19 a biomarkerov umožňujúcich skorú detekciu jedincov so zvýšeným rizikom ťažkého priebehu ochorenia, kód ITMS: 313011ATA2, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja a s podporou Agentúry na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. PP-COVID-20-0056.

 

LITERATÚRA

1. http s://www.health.gov.sk/Clanok?koronavirus-pripad-prvy-opatrenia, dostupné dňa 23. 11. 2022
2. https://www.health.gov.sk/Clanok?koronavirus-krizovy-stab-opatrenia, dostupné dňa 23. 11. 2022
3. https://mapa.covid.chat/, dostupné dňa 23. 11. 2022
4. https://www.uvzsr.sk/index.php?option=com_content&view=article&id=4590:britska-mutacia-bola-na-slovensku-u-v-novembri-v-trenine-mohla-pred-sviatkami-dominova&catid=250:koronavirus-2019-ncov&Itemid=153, dostupné dňa 23. 11. 2022
5. Srivastava S, Banu S, Singh P, et al. SARS-CoV-2 genomics: An Indian perspective on sequencing viral variants. Journal of Biosciences 2021; 46(1): 22.
6. Davies NG, Abbott S, Barnard RC, et al. Estimated transmissibility and impact of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 in England. Science 2021; 372(6538): eabg3055.
7. Starr TN, Greaney AJ, Hilton SK, et al. Deep Mutational Scanning of SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain Reveals Constraints on Folding and ACE2 Binding. Cell 2020; 182(5): 1295-1310. e20.
8. Tegally H, Wilkinson E, Giovanetti M, et al. Detection of a SARS-CoV-2 variant of concern in South Africa. Nature 2021; 592(7854): 438-443.
9. Faria NR, Mellan TA, Whittaker C, et al. Genomics and epidemiology of the P.1 SARS-CoV-2 lineage in Manaus, Brazil. Science 2021; 372(6544): 815-821.
10. Syed AM, Taha TY, Tabata T, et al. Rapid assessment of SARS-CoV2-evolved variants using virus-like particles. Science 2021; 374(6575): 1626-1632.
11. Ong SWX, Chiew CJ, Ang LW, et al. Clinical and Virological Features of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Variants of Concern: A Retrospective Cohort Study Comparing B.1.1.7 (Alpha), B.1.351 (Beta), and B.1.617.2 (Delta). Clin Infect Dis 2022; 75(1): e1128-e1136.
12. Xu Y, Cheng M, Chen X, et al. Current approaches in laboratory testing for SARS-CoV-2. Int J Infect Dis 2020; 100: 7-9.
13. Mackay I. Real-time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Norfolk, England: Caister Academic Press 2007: 440.
14. Rao SN, Manissero D, Steele VR, et al. A Systematic Review of the Clinical Utility of Cycle Threshold Values in the Context of COVID-19. Infect Dis Ther 2020; 9(3): 573-586.
15. Tom MR, Mina MJ. To Interpret the SARS-CoV-2 Test, Consider the Cycle Threshold Value. Clin Infect Dis 2020; 71(16): 2252-2254.
16. https://korona.gov.sk/wp-ontent/uploads/2021/11/covid_automat_ signalizacny_system_4v3.pdf, dostupné dňa 19.12.2022
17. https://www.medirexgroupacademy.sk/wp-content/uploads/ 2021/06/Zavedenie-a-vyvoj-molekuloveho-testovania-SARS-CoV-2.pdf dostupné dňa 19.12.2022
18. https://www.dovera.sk/aktuality/4897-na-pcr-test-uz-treba-vymenny-listok, dostupné dňa 19.12.2022
19. https://www.vlada.gov.sk/od-pondelka-zacne-platit-covid-automat/, dostupné dňa 19.12.2022
20. https://korona.gov.sk/wp-content/uploads/2021/08/covid-automat_ signalizacny-system_4v1.pdf, dostupné dňa 19.12.2022
21. https://korona.gov.sk/covid-automat-na-slovensku/, dostupné dňa 19.12.2022