Abstrakt:

Úvod: Homogénne sa farbiace oblasti (hsr) podobne ako dmin predstavujú cytogeneticky viditeľný znak génovej amplifikácie. Je známe, že obsahujú kópie amplifikovaných DNA segmentov. Ich výskyt je častý v rôznych ľudských nádoroch, v hematologických malignitách ich však detegujeme zriedkavo. Ich úloha v leukemogenéze nie je jasná, sú však asociované s rýchlou progresiou ochorenia a krátkym prežívaním. Mechanizmus vzniku nie presne opísaný. Na cytogenetickej úrovni sa hsr deteguje ako veľká časť difúzne zafarbeného chromatínu včleneného do normálneho chromozómu.

Kazuistiky: Predstavujeme troch pacientov s de novo AML a MDS, ktorí boli v čase diagnózy vyšetrení na našom oddelení genetiky. U všetkých troch bola uskutočnená cytogenetická analýza, FISH a molekulová analýza metódou MLPA. Cytogenetická analýza G-prúžkovaných chromozómov po 24-hodinovej kultivácii buniek kostnej drene odhalila komplexný karyotyp s deléciou dlhého ramena chromozómu 5, prítomnosť hsr oblastí a mnohé ďalšie numerické a štruktúrne zmeny. FISH metóda pomohla odhaliť a špecifikovať aberácie a amplifikácie  a stanoviť ich percentuálne zastúpenie.

Výsledky: Všetci prezentovaní pacienti majú spoločné znaky: starší vek, de novo ochorenie AML alebo MDS   s komplexným karyotypom, ktorý obsahoval deléciu 5q oblasti, zlú prognózu a krátke prežívanie.

Kľúčové slová: homogénne sa farbiace oblasti, cytogenetická analýza, FISH, komplexný karyotyp

*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

 

Úvod

Leukémia je malígne ochorenie krvotvorných buniek, pri ktorom dochádza k zmnoženiu a hromadeniu nezrelých foriem bielych krviniek a tie postupne obsadzujú priestory v kostnej dreni a potláčajú normálnu krvotvorbu. S leukémiou sa spájajú rôzne štruktúrne chromozómové zmeny, ako sú translokácie, delécie, inverzie, adície, alebo numerické zmeny, ako sú aneuploidie, polyploidie chromozómov(1). Zriedkavo sa však (~ 1 %) stretávame s cytogeneticky viditeľným znakom amplifikácie DNA. Toto mnohonásobné zmnoženie DNA sa môže vyskytovať extrachromozómovo ako tzv. double minute (dmin), malé párové chromatínové telieska bez centroméry alebo intrachromozómovo, známe ako homogénne sa farbiace oblasti (hsrhomogenously staining region), keď je zmnoženie integrované do chromozómu (obrá- zok 1). Mechanizmus vzniku nie je úplne objasnený. Prvýkrát boli opísané v roku 1962 u pacientov s bronchogénnym karcinómom(2). Následkom amplifikácie DNA dochádza k zvýšenej expresii génov obsiahnutých v amplikóne, dochádza  k modifikácii normálneho bunkového delenia a prežívania buniek. Zmnoženie má potenciálny leukemogénny účinok  a je asociované s rýchlou progresiou ochorenia a krátkym časom prežívania. Najčastejšie amplifikovanými génmi sú MYC, MYCN (neuroblastóm), HER2/neu (nádory prsníka), KMT2A(3).

 

Materiál a metódy

V článku predstavujeme troch pacientov, u ktorých sme cytogenetickou analýzou detegovali homogénne sa farbiace oblasti a pomocou FISH metódy sme odhalili ich pôvod.

Na cytogenetickú analýzu boli použité vzorky kostnej drene kultivované 24 hodín v kompletnom kultivačnom médiu pri 37 °C a následne spracované podľa štandardných cytogenetických postupov. Preparáty boli farbené Wrightovým roztokom a u každého pacienta bolo hodnotených 20 G-prúžkovaných metafáz. Karyotyp bol zapísaný podľa International System of Chromosome Nomenclature (ISCN)(4).

Na FISH analýzu boli použité suspenzie pripravené spomenutým postupom. Boli použité nasledovné sondy od firmy Metasystems XL Del(5)(q31), XL 7q22/7q36, XL TP53/ 17cen, XCE 8 Blue, XL 22q11 IGL BA, XL 20q12/20qter, XL Iso(17q), XCE 12 Orange, XL MLL plus, sonda ZytoLight® SPEC BCL2 DC BA od Zytovision a sonda LSI 21 SO od firmy Abbott. Preparáty a sondy boli denaturované, následne prebehla hybridizácia a hodnotenie 200 interfázových jadier pod fluorescenčným mikroskopom.

Na molekulovej úrovni sa u pacientov po izolácii DNA z kostnej drene alebo periférnej krvi realizovala MLPA analýza pomocou kitu MDS P414-A1. Technika deteguje len numerické zmeny, delécie a amplifikácie. Obsahuje 46 sond pre niekoľko chromozómov, ktoré majú diagnostický alebo prognostický význam pre pacientov s myelodysplastickým syndrómom (MDS) (chromozómy 3, 5q, 7q, 8q, 11q, 12p, 17, 19, 20q, Y).

 

Kazuistika č. 1

V júni 2016 sme na naše oddelenie prijali vzorku kostnej drene 78-ročnej pacientky s diagnózou akútna myeloblastová leukémia (AML) bližšie neurčeného typu. Na cytogenetickej úrovni sme analyzovali 20 G-bandovaných metafáz a stanovili sme komplexný karyotyp (obrázok 2): 47,XX,-der(5)t(5;21)(p11;q21),-17,+21,der(22)t(17;22)(q21;q10), +hsr(22)(q11)[20].

Na preparátoch sme uskutočnili aj FISH analýzu pomocou sond používaných pri diagnóze MDS a zachytili sme zmeny zhrnuté v tabuľke 1.

Vyšetrenie IGL génu lokalizovaného na chromozóme 22 bolo uskutočnené pomocou sondy XL IGL BA z Metasystems (obrázok 3). Detegovali sme amplifikáciu len zelenej 3´oblasti (obrázok 4), v ktorej sa nachádza gén BCR. Napriek tomu, že fúzny proteín bcr/abl patrí k veľmi skúmaným, nie je funkcia normálneho BCR génu úplne objasnená. Predpokladá sa, že má GTP-ázovú aktivitu a reguluje signálne dráhy v bunke(5). Zároveň sme pacientke detegovali stratu centroméry a krátkych ramien chromozómu 17, na ktorých je lokalizovaný tumorsupresorový gén TP53. Býva tiež označovaný ako strážca genómu. Jeho úlohou je udržovať genómovú stabilitu a integritu, regulovať expresiu mnohých génov s dôležitou úlohou pri bunkovom raste, delení, apoptóze, angiogenéze a má kľúčovú úlohu v ochrane pred tvorbou nádoru (6,7). MLPA analýza potvrdila amplifikáciu 22q11.21, deléciu 5q22-q34, 17p13.1, 17q11.2 a odhalila deléciu krátkych ramien chromozómu 3 (3p22.2) (obrázok 5). Pacientka exitovala ešte toho mesiaca.

 

Kazuistika č. 2

V apríli 2017 sme na naše oddelenie prvýkrát prijali vzorku periférnej krvi 73-ročného pacienta s diagnózou myelo- dysplastický syndróm (MDS). Na molekulovej úrovni bola realizovaná MLPA analýza, ktorá preukázala prítomnosť amplifikácie chromozómu 11 v oblasti q23.3-q24.3. O mesiac neskôr, v máji, sme prijali vzorku kostnej drene a vyšetrenie bolo doplnené o cytogenetiku a FISH analýzu. Po cytogenetickej analýze sme v 13 metafázach identifikovali komplexný karyotyp s marker chromozómom (obrázok 6): 45,XY,-5,der(11)t(5;11)(p13;q22),+hsr(11)(q23),der(12)t(11;12,?)(q23;q11;?),-18[6]/46,idem,+22[7]/46,XY[7]. Výsledky FISH analýz sú uvedené v tabuľke 2.

Pomocou sondy MLL plus dc (obrázok 7) sme odhalili, že marker chromozóm je celý tvorený namnoženým génom KM- T2A (starší názov MLL) a zároveň na chromozóme 11 sa tiež vyskytuje KMT2A gén dvakrát za sebou (obrázok 8). KMT2A gén kóduje transkripčný koaktivátor, ktorý má dôležitú úlohu v regulácii génovej expresie počas včasného vývoja a hematopoézy(8).

Na obrázku 9 je odhalená delécia oblasti 5q31, ktorá spôsobuje, že nezrelé krvné bunky nie sú schopné dodiferencovať sa normálne a výsledkom je veľa nezrelých foriem buniek a málo zrelých. Najčastejšie deletovaný región DNA obsahuje 40 génov.

Na obrázku 10 je potvrdená trizómia chromozómu 22 pomocou FISH metódy. Pacient koncom júna 2017 exitoval.

Kazuistika č. 3

Vzorka kostnej drene 68-ročného pacienta bola v našom laboratóriu prvýkrát vyšetrená v januári 2017. Diagnóza bola myelodysplastický syndróm. V 10-tich metafázach sme určili nasledovný komplexný karyotyp (obrázok 11): 47,XY,del(5)(q15q33),der(7)del(7)(q11)t(3;7)(q13;q11), +hsr(21)(q22)[10]/46,XY[10]. Vyšetrenie kostnej drene bolo doplnené o FISH analýzu a výsledky sú zhrnuté v tabuľke 3. V oblasti 21q22, ktorá bola vyšetrená sondou LSI 21 SO (obrázok 12) a bola detegovaná amplifikácia (obrázok 13), sa nachádza gén RUNX1 (starší názov AML1). Tento gén kóduje transkripčný faktor zodpovedný za reguláciu diferenciácie hematopoetických buniek na zrelé bunky(9). Pomocou sondy XL 7q22/7q36 bola potvrdená strata dlhých ramien chromozómu 7, keď ostali v karyotype len krátke ramená a centroméra chromozómu 7 (modrá farba, obrázok 14). MLPA analýza potvrdila deléciu 5q22.2-q33.1 a 7q22.3-q36.1 a odhalila deléciu 3p22.2, nezachytenú na cytogene- tickej úrovni.

Pacient v marci 2017 exitoval.

 

Diskusia

Homogénne sa farbiace oblasti sú chromozómové miesta s mnohonásobným opakovaním (~20 – 100) segmentov DNA. Sú charakteristickým znakom malígneho procesu a zvyčajne sú detegované v pokročilých štádiách malígneho procesu spojené so zlou prognózou. Následkom zmnoženia sa môžu vytvárať rôzne veľké markery vyskytujúce sa samostatne alebo sa môžu včleniť do chromozómu. Keďže sa farbia rovnomerne, ich identifikácia pomocou G-bandu je veľmi náročná. Na odhalenie pôvodu zmnoženia sa preto najčastejšie využíva FISH metóda.

Hoci boli opísané amplifikácie rôznych génov, najčastejšie amplifikované sú gény z malej génovej rodiny MYC (MYC, MYCN, and MYCL). Sú identifikované v mnohých solídnych nádoroch, ako sú nádory mozgu, prsníka, pankreasu, neuroblastóm. V hematologických malignitách sa vyskytujú zriedka, okolo 1 %(10). Tu často amplifikovaným génom býva KM- T2A, ktorého amplifikáciu sme detegovali u nášho jedného pacienta. KMT2A gén je lokalizovaný v lokuse 11q23 a v leukémiách sa vyskytuje hlavne v translokáciách, doteraz bolo identifikovaných viac ako 80 jeho fúznych partnerov(11).

Pacienti s amplifikáciou 11q23 sa vyskytujú pomerne zriedkavo, majú však niektoré črty veľmi podobné: sú to pacienti staršieho veku, s de novo ochorením AML/MDS, s komplexným karyotypom a krátkym prežívaním. U 90 % pacientov je tiež prítomná delécia dlhých ramien chromozómu 5, ktorej veľkosť varíruje, ale všetkým pacientom chýba oblasť 5q31(12).

Druhým najmenším chromozómom v karyotype, ktorý obsahuje ~ 600 génov, je chromozóm 22. Pomocou FISH metódy sme detegovali amplifikáciu jeho 3´oblasti q11, v ktorej sa nachádzajú gény IGLC a BCR. IGLC kóduje imunoglobulínový lambda reťazec, ktorého prestavba je prítomná hlavne v lymfómoch. Pri hematologických malignitách je amplifikácia génu BCR zriedkavá, najčastejšie je gén opisovaný v translokácii t(9;22)(q34;q11), na molekulovej úrovni fúzia bcr/abl.

Obrázok 13. FISH analýza pomocou sondy LSI 21 SO znázorňujúca amplifikáciu 21q22

Obrázok 14. FISH vyšetrenie pomocou sondy XL 7q22/7q36, šípkou je znázornený deletovaný chromozóm

Gén BCR kóduje proteín so serín/treonínkinázovou aktivitou zahrnutý v signálnej transdukcii, jeho presná úloha však nie je odhalená(5).

Tretím chromozómom, na ktorom sme potvrdili amplifikáciu, bol chromozóm 21. Použitá sonda LSI 21 SO hybridizuje k oblasti 21q22. Ktorý gén z danej oblasti je presne amplifikovaný, nevieme, ale kandidátnym génom je gén RUNX1 (21q22.1). RUNX1 gén zohráva významnú úlohu pri hematopoetickej diferenciácii a v mnohých iných bunkových funkciách. Patrí ku génom, ktoré sú pri leukémiách častým cieľovým miestom translokácií. S amplifikáciou génu RUNX1 sa stretávame hlavne pri detských akútnych leukémiách, no môže sa vyskytovať aj u dospelých s komplexným karyotypom a je spojená so zlou prognózou(13,14).

 

Záver

Hsr/dm sa vyskytujú prevažne u starších pacientov s diagnózou AML alebo MDS. U pacientov je prítomný komplexný karyotyp s deléciou dlhých ramien 5. chromozómu so spoločnou deletovanou oblasťou 5q31. S komplexnými zmenami sa tiež spája strata génu TP53 z chromozómu 17. Pacienti s hsr/dm majú zlú prognózu a krátke prežívanie, čo sa potvrdilo u všetkých nami prezentovaných pacientov.

 

LITERATÚRA

  1. Juliusson, & Hough, R., 2016. Leukemia. Tumors in Adolescents and Young Adults, 87-100.
  2. Schwab Oncogene amplification in solid tumors. Cancer Biology 1999; 9: 319-325.
  3. Levan G in Encyclopedia of Elsevier Science Inc. Thomas L, 2001; p. 963.
  4. McGowan-Jordan J, Simons A, Schmid ISCN An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. Paris: Karger 2016.
  5. https://ghr.nlm.nih.gov/gene/BCR
  6. https://ghr.nlm.nih.gov/gene/TP53
  7. https://en.wikipedia.org/wiki/P53
  8. https://ghr.nlm.nih.gov/gene/KMT2A
  9. https://ghr.nlm.nih.gov/gene/RUNX1
  10. Movafagh A. Homogeneously Staining Regions or Double Minute Chromosomes in Leukemia. Iranian journal of blood and cancer 2012; 2: 101-102.
  11. Nguyen D, Haley L, Pallavajjala A, et Identification of a novel KMT2A-SEPT14 fusion in acute myeloid leukemia. Leukemia and Lymphoma 2018; 59(1): 265-267.
  12. Herry A, Douet-Guilbert N, Guéganic N, et Del(5q) and MLL amplification in homogeneously staining region in acute myeloblastic leukemia: a recurrent cytogenetic association. Annals of Hematology 2006; 85: 244-249.
  13. Baldus C, Liyanarachchi S, Mrózek K, et al. Acute myeloid leukemia with complex karyotype and abnormal chrosomome 21: Amplification discloses overexpression of APP, ETS2 and REG genes. PNAS 2004; 101(11): 3915-3920.
  14. Mikhail FM, Sinha KK, Saunthararajah Y, et Normal and transforming functions of RUNX1: A perspective. Journal of cellular Physiology 2006; 207(3): 582-593.