*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom 
PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Kongenitálne poruchy glykozylácie (CDG) sú rýchlo rozširujúcou sa skupinou zriedkavých dedičných metabolických ochorení, zapríčinených poruchou v jednej z najdôležitejších posttranslačných modifikácií proteínov – glykozylácii. V ľudskom tele sa viac než polovica všetkých proteínov a väčšina membránových  a sekrečných proteínov (1) nachádza v glykozylovanej forme. Glykány sa kovalentne viažu na proteíny: cez atóm kyslíka na serínové alebo threonínové zvyšky (O-viazané oligosacharidy) alebo cez atóm dusíka na asparagínové zvyšky proteínov (N-viazané oligosacharidy) (2).

V posledných rokoch sa postupne  začal zisťovať vzťah medzi aberantnou glykozyláciou a mnohými ochoreniami. Zmeny v glykozylačnom profile boli zistené u pacientov trpiacich Alzheimerovou chorobou (3) a vo viacerých biomarkeroch u pacientov trpiacich rôznymi typmi nádorových ochorení bolo potvrdené, že onkogenéza je často v korelačnom vzťahu so zmenami v oligosacharidovej štruktúre (4). Glykozylačný  proces je komplexný a zahŕňa stovky špecifických  enzýmov, transportérov. Zúčastňuje sa ho 250 – 500 génov, čo reprezentuje 1 % z celého ľudského genómu (5). V roku 1997 boli známe  tri defekty génov zúčastňujúcich  sa N-glykozylačného procesu, v roku 2011 bolo vďaka neustálemu  rozvoju moderných analytických metód známych približne 50 subtypov týchto ochorení  (6). Počet známych  subtypov neustále narastá (7) a predpokladá sa, že mnoho  pacientov stále zostáva nediagnostikovaných (obrázok 1). U približne 40 % CDG pacientov konkrétny enzymatický defekt, a teda aj molekulárna podstata týchto ochorení zostáva stále neobjasnená.

Klinické príznaky

Porucha v jedinom géne zúčastňujúcom sa glykozylačného procesu vedie k širokej škále symptómov, ktoré potenciálne zasiahnu viaceré orgány a klinické príznaky sú veľmi nešpecifické. CDG môže postihnúť akýkoľvek orgán ľudského tela, avšak väčšinou tieto ochorenia  bývajú multisysté- mové a postihujú jeden alebo viaceré orgány. Môžu byť život ohrozujúce, ale aj s miernym priebehom. CDG patria do skupiny ťažko diagnostikovateľných ochorení pre ich častokrát nešpecifickú klinickú manifestáciu ochorenia. Mnohé CDG sú charakteristické poruchami  v centrálnom nervovom systéme (hypotónia, záchvaty, oneskorený  vývoj, kognitívne poruchy a cerebelárna  hypoplázia vedúca  k problémom  s rovnováhou a koordináciou). Ďalšími symptómami sú hepatopatia, kardiomyopatia, abnormálna distribúcia tuku, koagulačné poruchy, gastrointestinálne ťažkosti, strabizmus, tvárový dysmorfizmus, poruchy prehĺtania a poruchy rastu.

Možnosti diagnostiky

V súčasnosti je alarmujúci neustále rastúci tlak na skríning a diagnostiku tejto skupiny dedičných metabolických porúch v našej krajine. Napriek tomu, že CDG sú vrodenými metabolickými poruchami, nie sú súčasťou novorodeneckého skríningového programu. Pacienti s kongenitálnymi poruchami N- a O-glykozylácie sú zachytávaní cestou selektívneho skríningu na základe špecifických klinických symptómov a laboratórnych nálezov. S neustálym rozvojom robustných analytických metód vo svete stúpa aj známa prevalencia, zatiaľ čo molekulárna podstata ostáva v mnohých prípadoch stále neobjasnená.

Izoelektrická fokusácia

V roku 2012 bola v Centre dedičných metabolických porúch (CDMP) DFNsP Bratislava zavedená metóda selektívneho skríningu CDG založená na izoelektrickej fokusácii (IEF) sérového transferínu. Táto metóda v súčasnosti predstavuje zlatý štandard uplatňujúci sa všade vo svete na záchyt pacientov s poruchami glykozylácie. CDMP je v súčasnosti jediné pracovisko na Slovensku, ktoré sa zaoberá skríningom CDG. Tento test rozdeľuje glykoizoformy na základe náboja, čím umožňuje odlíšiť zdravých jednotlivcov od suspektných pacientov s poruchou  N-glykozylácie podtypu I alebo  II. U CDG I pacienta  je v IEF profile prítomný  asialoa vo veľkom množstve  disialotransferín, kým tetrasialotransferín sa v sére nachádza v nižšej koncentrácii v porovnaní s kontrolnou vzorkou séra od zdravého jedinca (pozri obrázok 2) (8). Získaný patologický profil glykoizoforiem však nevypovedá o konkrétnom enzymatickom  deficite. Okrem primárnych porúch  N-glykozylácie  I. a II. podtypu  zachytáva  CDMP aj sekundárne patologický  profil v obraze IEF transferínu u pacientov s hereditárnou intoleranciou  fruktózy, galaktozémiou, závislosťou od alkoholu, ale aj pri polymorfizme transferínu, ťažkých ochoreniach  pečene a u pacientov s hemolyticko-uremickým  syndrómom. IEF sérového  transferínu teda umožňuje  detegovať  glykozylačné defekty vedúce k zníženej sialyzácii, avšak neposkytuje dostatočné rozlíšenie potrebné na objasnenie špecifických enzymatických  defektov, a teda neumožňuje  diagnostiku konkrétneho subtypu.

Štruktúrna analýza N-viazaných glykánov

Na ďalšiu diagnostiku špecifického subtypu a konkrétneho enzymatického deficitu vznikla spolupráca medzi  klinikmi a vedcami z Centra excelentnosti pre glykomiku (CEG), Chemický  ústav SAV, ktorá otvára nové možnosti v personalizovanej medicíne. Vzorky od pacientov s pozitívnym výsledkom skríningu sa spracujú prístupom analýzy N-glykoprofilu celkového séra alebo analýzy N-glykoprofilu zvoleného biomarkera (napríklad sérového transferínu) izolovaného imunoafinitnou preparatívnou chromatografiou. N-glykány sú uvoľnené prostredníctvom enzymatickej deglykozylácie, frakcionované a fluorescenčne značené za účelom stanovenia ich štruktúr pomocou  LC-MS (tzv. „offline“ prepojenie HIAX HPLC chromatografie a MALDI TOF/ TOF hmotnostnej spektrometrie).

Reprezentatívna analýza sialylovanej frakcie celkového N-glykoprofilu ľudského séra je zobrazená  na obrázku 3. Prípadné zmeny  v špecifickom kroku syntézy N-glykánových  štruktúr sú tak detegovateľné  na kvanti- tatívnej  i kvalitatívnej  úrovni, vďaka čomu môžu byť predpokladom pre vybraný konkrétny enzymatický  defekt. Tým sa mnohonásobne zužuje okruh potenciálnych  kandidátnych glykogénov zúčastňujúcich  sa glykozylačného procesu.

Štruktúrna analýza O-viazaných glykánov apolipoproteínu CIII

V CEG Chemického  ústavu SAV bola na sledovanie prípadných porúch v O-glykozylácii v roku 2015 zavedená metóda stanovenia O-glykoprofilu apolipoproteínu CIII (9). Sérové lipoproteínové  komplexy  sú mechanicky rozbité a následne je vzorka odsolená pomocou  chromatografie na reverznej fáze. V MALDI TOF hmotnostnom spektre takto pripravenej vzorky je možné  pozorovať  jednotlivé  signály prislúchajúce  asialo-, monosialo- a disialo-O-glykoizoformám, ktorých relatívny pomer a jeho zmeny môžu vypovedať o poruchách v procesoch O-glykozylácie.

Sekvenovanie novej generácie

Ďalšie možnosti otvára analýza na úrovni DNA, pri ktorej sa na základe štruktúrneho profilu glykánov vymedzí súbor potenciálne postihnutých glykogénov. Takto vytipované  gény sú ďalej podrobené genomickej analýze na zistenie mutácií potenciálne  zodpovedných  za vznik tohto typu ochorení. Testovanie na úrovni jedného génu nemá význam, pretože presná príčina vzniku ochorenia  nie je známa. V prípade symptomatiky CDG ochorení ide o multisystémové zlyhanie, a to utvára predpoklad, že sa sledovaná mutácia môže vyskytovať v ktoromkoľvek z génov (jednom či viacerých) zúčastňujúcich sa biosyntetickej dráhy glykánov. Na analýzu glykogénov bude preto použité sekvenovanie novej generácie ako veľmi robustná metóda, pri ktorej je možné  súčasne analyzovať viacerých pacientov a veľké množstvo génov v jednom sekvenačnom behu. Neustále znižovanie ceny, zjednodušovanie  prípravy vzoriek a čoraz väčšie množstvo dát získaných z jediného sekvenačného behu radí túto metódu medzi progresívne sa rozvíjajúce metódy v diagnostike  aj v základnom výskume. Na analýzu vytipovaných génov sa používajú prednastavené panely génov dodávané výrobcom. Analyzujú sa celé exóny vopred vytipovaných génov postihnutých jedincov, ako aj parentálnej generácie na zistenie genetického pozadia CDG ochorení (10).

Sekvenovaním exónových častí kandidátnych génov sa nemusia za- chytiť všetky mutácie spôsobujúce ochorenie. Existuje totiž predpoklad, že približne 15 % pacientov má mutáciu v nekódujúcich  oblastiach sledovaných génov. Z tohto dôvodu  je nevyhnutné  podrobiť sekvenčnej analýze nielen oblasti, v ktorých dochádza  k zostrihu, ale aj hlboké intrónové oblasti sledovaných  génov  (11).

Perspektíva CDG

Objav vhodných terapeutických prístupov v liečbe CDG stále ostáva významnou výzvou, nakoľko sa celková prevalencia týchto ochorení v USA odhaduje až na 1 : 10 000 (7). V priebehu roku 2013 bol vo svete nový známy CDG subtyp reportovaný každých 17 dní, a to práve vďaka vývoju stále citlivejších analytických metód, ktoré sú dnes dostupné aj na pôde Slovenskej republiky. Napriek obrovskému rozvoju diagnostických možností sa však stále predpokladá, že väčšina CDG pacientov ostáva poddiagnostikovaných. Od roku 2012 je v našej krajine dostupná efektívna skríningová metóda, ktorá umožňuje záchyt pacientov s CDG. Na lepšie poznanie CDG a príčin ich vzniku bude preto v budúcnosti nevyhnutná užšia spolupráca  medzi výskumnými  pracoviskami a diagnostickými laboratóriami. Len aplikáciou molekulárno-biologických dát v spolupráci s poznatkami o glykozylácii proteínov sa umožní rozširovanie panelu kandidátnych génov potenciálne zodpovedných za tento typ ochorení (5). Na diagnostiku porúch  súvisiacich s metabolizmom glykokonjugátov je preto limitujúce zavedenie rýchlych, presných a spoľahlivých metód.

Záver

Poruchy glykozylácie sú v našej krajine poddiagnostikované z rôznych dôvodov: neuspokojivé  lekárske povedomie, vysoká mortalita v prvom roku života, ako aj nedostupnosť v minulosti štandardného skríningo- vého laboratórneho testu. Keďže ide o zriedkavé ochorenia, úspešnosť záchytu  i dôkladná  diagnostika, až na úrovni štruktúrnej analýzy glykánov či mutačnej analýzy celých panelov glykogénov, závisí aj od dobrej spolupráce klinických pracovísk s pracoviskami výskumného, respektíve akademického charakteru. Iba včasná a presná diagnostika dokáže napomôcť stanoveniu správnej diagnózy u pacienta, prípadne prenatálnej diagnostiky pri ďalšej gravidite matky, pochopeniu molekulárnej podstaty týchto ochorení, ako aj zabráneniu prípadného ireverzibilného poškodenia organizmu.

Poďakovanie: Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a vývoj pre projekt: Centrum excelentnosti pre glykomiku, ITMS 26240120031, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionál- neho rozvoja. Osobitné poďakovanie patrí aj celému Centru dedičných meta- bolických porúch v Bratislave za vysoko odbornú spoluprácu tohto klinického pracoviska s Chemickým ústavom SAV.

Literatúra
1. Durand G, Seta N. Protein Glycosylation and diseases: Blood and urinary oligosaccharides as markers for diagnosis and therapeutic monitoring. Clin Chem. 2000;46(6):795–805.
2. Solá RJ, Griebenov K. Glycosylation of Therapeutic Proteins: An Effective Strategy to Optimize Efficacy. BioDrugs. 2010;24(1):9–21.
3. Abou-Abbass H, Abou-El-Hassan H, Bahmad H, et al. Glycosylation and other PTMs alterations in neurodegenerative diseases: Current status and future role in neurotrauma. Electroph. 2016; published online.
4. Ferreira JA, Magalhães A, Gomes J, et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Canc Letters. 2016; in press.
5. Jones MA, Hegde MR. Congenital Disorders of Glycosylation. Molecular Pathology in Clinical Practice. New York: Springer International Publishing; 2016: 121–125.
6. Morava E, Lefeber D. CDG – an update. J Inherit Metab Dis. 2011;34(4):847–48.
7. Freeze HH. Understanding human glycosylation disorders: Biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 2013;288:6936–45.
8. Dörre K, Olczak M, Wada Y, et al. A new case of UDP-galactose transporter deficiency (SLC35A2-CDG): molecular basis, clinical phenotype, and therapeutic approach. J Inh Met Dis. 2015;38(5):931–940.
9. Wada Y, et al. Mass spectrometry of apolipoprotein C-III, a simple analytical method for mucin-type O-glycosylation and its application to an autosomal recessive cutis laxa type-2 (ARCL2) patient. Glycobiol. 2012;22(8):1140–1144.
10. Jones MA, Rhodenizer D, da Silva C, et al. Molecular diagnostic testing for congenital disorders of glycosylation (CDG): detection rate for single gene testing and next generation sequencing panel testing. Mol gen metab. 2013;110(1):78–85.
11. Raffan E, Semple RK. Next generation sequencing-implications for clinical practise. Brit Med Bull. 2011;99:53–71.