*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.

Úvod

Predkladaný článok opisuje prípad pacientky s akútnou gastroenteritídou, keď pôvodcom ochorenia bol potvrde­ný raritný patogénny mikroorganizmus V. cholerae non-O1, non-O139. Bola to prvá laboratórne potvrdená identifikácia tejto baktérie v klinickej vzorke na našom pracovisku a pod­ľa našich informácií aj na Slovensku. Infekcia sa prejavila u zdravej imunokompetentnej ženy po konzumácii vody zo studne a mala ťažší a dlhotrvajúci priebeh.

Kazuistika pacientky

Štyridsaťštyriročná pacientka navštívila koncom júna 2017 svoju obvodnú lekárku s príznakmi silnej hnačky, s ab­dominálnymi bolesťami sprevádzaným tenezmami a vysoký­mi teplotami okolo 38,5 °C. Pacientka bola dehydratovaná, pochudnutá, príznaky vracania sa nevyskytovali. V ambu­lancii boli urobené odbery biologických vzoriek vrátane výteru z rekta. Štandardné biochemické analýzy aj krvný ob­raz boli u pacientky v norme, avšak kultivačná analýza výteru z rekta potvrdila infekčnú príčinu jej klinických prejavov. Vo vzorke boli identifikované baktérie druhu Vibrio cholerae non-O1, non-O139. Keďže ide o patogénny mikroorganizmus, ktorý sa v našom regióne v klinických vzorkách ešte nevy­skytol a jeho identifikácia je z nášho pohľadu raritná, upo­vedomili sme o tejto skutočnosti ošetrujúceho lekára, infek- tológa a príslušného epidemiológa. Pacientka bola liečená ambulantne, nebola hospitalizovaná. Naordinovaná jej bola symptomatická liečba Smecta, Hylak Forte a rehydratačný nápoj Fluidex. Vzhľadom na pretrvávajúce ťažkosti, ku kto­rým sa pridalo aj vracanie, bola v polovici júla 2017 naor­dinovaná cielená antibiotická terapia podľa stanovenej cit­livosti – ciprofloxacín 500 mg 2x d á 12 h počas 10 dní. Po počiatočnej úľave sa jej klinický stav opäť zhoršil, trpela ne­chutenstvom, problémami s trávením, občasnými hnačkami. Liečbu antibiotikami prerušila a pokračovala v symptomatic­kej liečbe. Prítomnosť patogénnej baktérie Vibrio cholerae non-O1, non-O139 bola potvrdená v stolici pacientky ešte aj v septembri 2017. Po trojnásobnom selektívnom namnože­ní v alkalickej peptónovej vode bola kultivačne dokázaná aj prítomnosť V. metschnikovii, čo je blízky príbuzný V. cholerae s negatívnou cytochrómoxidázovou aktivitou. Klinický stav pacientky sa zlepšoval veľmi pomaly, dlhodobo pretrvávalo nechutenstvo, abdominálne bolesti, hnačky, ktoré sa strieda­li s obdobiami relatívnej úľavy od ťažkostí. Od októbra 2017 je pacientka bez klinických príznakov infekcie. Zdroj infekcie bol potvrdený epidemiologickým vyšetrením, bola ním voda zo studne, ktorú v domácnosti z dôvodu absencie vodovo­du používali.

Epidemiologické vyšetrenie zdroja infekcie

Na základe odporúčania pracovníkov odboru epidemio­lógia RÚVZ so sídlom v Leviciach boli vykonané kontrolné odbery vzoriek od ostatných členov rodiny, u ktorých neboli prítomné žiadne klinické príznaky ani ťažkosti. Výsledky kon­trolných odberov biologických vzoriek zostali negatívne. Ke­ďže najčastejším faktorom prenosu infekcie je voda alebo potraviny, na objasnenie bolo nutné došetriť riziko konzumá­cie infikovaného jedla alebo vody v priebehu 7 dní pred ob­javením klinických príznakov. Pacientka neabsolvovala po­byt v zahraničí, vylúčila konzumáciu morských živočíchov, ako sú mušle, ustrice, kraby a pod., nekúpala sa v prírod­nom jazere. Jediným rizikovým faktorom bola používaná vo­da, keďže v domácnosti nebol zavedený vodovodný systém a rodina používala vodu zo svojej studne. Vzorky vody boli odobraté podľa platných noriem a zaslané na cielené vyšet­renie do NRC pre Vibrionaceae so sídlom v Komárne. NRC po­tvrdilo vo vzorkách vody prítomnosť baktérie Vibrio cholerae non-O1, non-O139. Všetky prípady infekcií spôsobených sé- roskupinami V. cholerae a ďalšími patogénnymi druhmi rodu Vibrio spp. podliehajú povinnému systému hlásenia u nás aj celosvetovo (CDC).

Klinický význam infekcií spôsobených Vibrio cholerae

Infekcie spôsobené rôznymi séroskupinami Vibrio cho­lerae sa vo vyspelých krajinách, napr. v EÚ, vyskytujú veľmi zriedka. V súčasnosti je známych viac ako 200 séroskupín druhu V. cholerae, ktoré sa líšia somatickým O antigénom⁽²⁾. Klinický priebeh ochorenia závisí z veľkej miery od séroskupiny, ktorou je pacient infikovaný. V. cholerae toxigénna séroskupina O1 alebo O139 (endemický sa vyskytuje v Ázii, vyskytli sa viaceré importované prípady aj vo svete) je vyvo­lávateľom prudkého a závažného ochorenia – cholery, kto­rá prebieha vo forme epidémie. Cholera sa vyskytuje v me­nej rozvinutých krajinách, ako je Ghana, India, Pakistan, Haiti a podľa WHO každoročne spôsobuje 28 000 – 142 000 úmrtí. Do Európy ju importujú v ojedinelých prípadoch cestovatelia vracajúci sa z rizikových oblastí. Podľa Európskeho centra na prevenciu a kontrolu chorôb (ECDC) bolo v roku 2014 v kraji­nách EÚ potvrdených len 16 prípadov cholery. Menej závaž­né ochorenia, tzv. vibriózy, sú spôsobené inými séroskupina­mi V. cholerae, ktoré sú označované ako V. cholerae non-O1 a non-O139, alebo inými patogénnymi druhmi: V. parahemoly­ticus, V. alginolyticus, V. vulnificus. Vibriózy sa prejavujú intestinálnou (gastroenteritídy) alebo extraintestinálnou (infekcie uší a rán) manifestáciou. Infekcie vznikajú primárne po kon­zumácii tepelne neupravených morských živočíchov, po po­žití kontaminovanej vody alebo po kúpaní v kontaminovanej vode. Vznik ochorenia je závislý od virulentnosti kmeňa aj od zdravotného stavu pacienta. Gastrointestinálne ochore­nia spôsobené V. cholerae non-O1, non-O139 na rozdiel od cholery prebiehajú menej prudko a nemajú epidemický po­tenciál. Klinické príznaky týchto infekcií môžu byť menej zá­važné: od asymptomatickej formy cez miernu hnačku až po závažné ochorenie podobné cholere. Prítomná je aj silná de­hydratácia a vysoké horúčky, ale ochorenie má dobrú prog­nózu. U pacientov s predispozíciou na bakteriémiu, ako sú imunokompromitovaní pacienti s ochoreniami pečene, alko­holici, diabetici a onkologickí pacienti, sa infekcia môže pre­javiť aj vo forme sepsy s vysokou mortalitou. Pacienti by ne­mali konzumovať tepelne neupravené morské živočíchy ani kúpať sa v potenciálne kontaminovaných vodách v letných mesiacoch⁽⁶⁾. Vysoká mortalita pri sepse je pravdepodobne spôsobená oneskorenou diagnostikou, neadekvátnou tera­piou antibiotikami aj dĺžkou terapie⁽⁴⁾. V odbornej literatúre je zaznamenaný narastajúci trend potvrdených infekcií spôso­bených V. cholerae non-O1, non-O139, pričom ich celkový po­čet vo vyspelých krajinách napr. Európskej únie zostáva stále nízky a infekcie sú ojedinelé⁽¹⁾.

Materiál a metódy

Laboratórna identifikácia baktérií rodu Vibrio spp.

Rod Vibrio patrí do čeľade Vibrionaceae. Sú to halofilné fakultatívne anaeróbne gramnegatívne paličky zakrivené na pozdĺžnej osi. Ochorenia spôsobené vibriami sú v súčas­nosti poddiagnostikované, jednak zo strany ošetrujúcich le­károv, ktorí na takúto etiológiu nemyslia, a jednak zo strany laboratórií, ktoré bežne nepoužívajú selektívne pôdy na izo­láciu baktérií rodu Vibrio⁽⁶⁾. Pri odbere biologického materiá­lu od pacienta je potrebný odber z charakteristického miesta v počiatočnom alebo rozvinutom štádiu príznakov ochore­nia ešte pred začatím ATB terapie. Vhodné biologické vzor­ky pri podozrení na infekciu sú stolica, výter z rekta, vývratky, výter z rany; v prípade sepsy (spôsobovanej hlavne V. vulni­ficus) aj krv na hemokultiváciu. V prípade vyšetrovanej pa­cientky nebola stanovená jasná diagnóza, preto bol použitý rutinný postup spracovania biologickej vzorky bez použitia selektívnej pôdy pre vibriá (napr. tiosíran – citran – žlč – sa- charózový agar – TCBS). Suspektný kmeň bol izolovaný len na selektívnej pôde pre Yersinia spp. Identifikácia izolova­ného kmeňa prebehla na základe hlavných biochemických vlastností (napr. oxidáza) komerčne dodávanou súpravou Enterotest a pomocou hmotnostnej spektrometrie MALDI-TOF. Vzhľadom na raritný nález patogénneho mikroorganizmu Vi­brio spp. vo vzorke bol kmeň zaslaný na definitívnu identifi­káciu na špecializované pracovisko NRC pre Vibrionaceae.

Nadstavbová diagnostika v NRC pre Vibrionaceae

Potvrdenie nálezu a definitívny výsledok identifiká­cie bol vykonaný v NRC pre Vibrionaceae na RÚVZ so síd­lom v Komárne. Kmeň bol potvrdený ako Vibrio spp. na zá­klade mikroskopického nálezu zahnutých gramnegatívnych paličiek, pozitívnej cytochrómoxidázovej aktivity, pozitív­neho string-testu, typického rastu na selektívnom TCBS-agare a citlivosti na vibriostatikum O129. Biochemicky, pomo­cou klasických skúmavkových testov s prídavkom 1 % NaCl, bol bližšie identifikovaný ako V. cholerae. Pomocou latexo­vej aglutinácie nebola dokázaná príslušnosť k séroskupine O1 ani O139. Napriek tomu bol kmeň testovaný metódou re­verznej pasívnej latexovej aglutinácie na prípadnú produkciu cholerového toxínu s negatívnym výsledkom. Baktéria bola finálne identifikovaná ako netoxinogénny kmeň V. cholerae non-O1, non-O139.

Metódou selektívneho namnoženia v alkalickej peptónovej vode bolo V. cholerae non-O1, non- O139 izolované aj zo vzorky studničnej vody. Vzorka vody sa podľa štandardných postupov odoberá do sterilných vzorkovníc (sklenených ale­bo plastových) v objeme 0,5 až 1 liter. Chladenie vzorky po­čas prepravy môže izoláciu vibrií sťažiť alebo znemožniť – navodenie prechodu do tzv. VBNC (viable but non-culturable) stavu. Z tohto dôvodu sa chladenie vzorky pri preprave ne­odporúča a vzorka vody by sa mala spracovať v deň odberu.

Všetky tri izoláty boli podrobené zisťovaniu príbuznosti metódou (GTG)5 PCR s následnou klastrovou analýzou zís­kaných profilov v softvéri PhoretixID Pro za využitia dvoch rôznych prístupov – Diceov algoritmus a Pearsonova korelá­cia. Obe analýzy ukázali veľmi blízku príbuznosť/totožnosť izolovaných kmeňov, ktoré teda môžu byť považované za je­den kmeň (obrázok 1).

Stanovenie citlivosti na antibiotiká a liečba infekcie

Hnačka spôsobená V cholerae (toxigénnymi aj netoxigénnymi kmeňmi) je riešená primárne rehydratáciou a ciele­nou terapiou antibiotikami. Najdôležitejšia je náhrada teku­tín a elektrolytov, ktoré sa počas ochorenia strácajú, jednak perorálnou formou, jednak intravenózne. Antibiotická terapia v prípade cholery je presne stanovená. Tetracyklín a azitromycín sú antibiotikami prvej voľby. Skracujú čas vylučovania baktérií a redukujú objem stolice o 50 %⁽⁵⁾. V prípade gastrointestinálnych infekcií V cholerae non-O1, non-O139 sa poda­nie antibiotík odporúča v prípade komplikovaných ochorení a u imunokompromitovaných pacientov. V analógii s chole­rou sú to tetracyklíny, ktoré inhibujú syntézu proteínov, čím znižujú produkciu toxínu, alebo skupina fluorochinolónov. Rozhodnutie o terapii závisí aj do lokálneho stavu citlivos­ti na antibiotiká, resp. rezistencie. Pri izolovanom kmeni bo­lo stanovenie citlivosti vykonané diskovým difúznym testom na Muellerových-Hintonových agarových pôdach a komerč­ne dodávanými antibiotickými diskmi podľa štandardných postupov EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Keďže aktuálne normy EUCAST neob­sahujú interpretačné kritériá pre V cholerae, boli použité kri­tériá pre Enterobacteriaceae. Izolovaný kmeň bol rezistentný proti kotrimoxazolu, intermediárne citlivý na ampicilín a gentamicín a citlivý na ciprofloxacín a tetracyklín. Dĺžka terapie závisí od zdravotného stavu pacienta, priebehu a závažnosti ochorenia. Medián je 14 dní. Na základe stanovenej citlivos­ti bol v terapii cielene použitý perorálny ciprofloxacín v dáv­ke 0,5 g 2x denne. Pôvodne bol navrhnutý na 10 dní, ale pa­cientka nebola schopná dodržať dĺžku terapie vzhľadom na ťažší priebeh ochorenia. Vakcína proti infekciám spôsobe­ným V. cholerae non-O1, non-O139 v súčasnosti neexistuje.

Diskusia

Napriek tomu, že ochorenie vypuklo u imunokompetentnej pacientky, jeho priebeh bol vážny a klinické príznaky pretrvá­vali dlhodobo. Identifikácia Vibrio cholerae non-O1, non-O139 ako príčiny ochorenia bola prekvapujúca, ale umožnila nasta­venie adekvátnej a cielenej terapie. Prirodzeným prostredím vibrií je more a pobrežné vody, ale V. cholerae, V. metchnikovii a V. mimicus dokážu osídľovať aj vody s nízkou salinitou, ako sú jazerá (napr. Neziderské jazero, Rakúsko, ale aj viace­ré slovenské jazerá), povrchové a odpadové vody. Vibriá sú schopné prežívať niekoľko týždňov aj vo výkaloch, ich počet narastá najmä v letných mesiacoch, keď sa teplota vody zvy­šuje. Zdroj infekcie u pacientky bol potvrdený. Infekcia bo­la spôsobená konzumáciou, resp. používaním kontaminova­nej vody z plytkej kopanej studne, ktorú v domácnosti denne využívali. Príčina kontaminácie vody v studni zostáva nejas­ná, dôvodom môže byť kontaminácia a presakovanie z oko­litého prostredia do studne a množenie infekčných agensov v letných mesiacoch. Napriek tomu, že baktérie sa vyskytujú v prostredí, zostávajú infekcie spôsobené vibriami ojedinelé a raritné. Prezentovaný prípad infekcie potvrdzuje, že treba venovať zvláštnu pozornosť zdravotnej bezchybnosti pitnej a úžitkovej vody, odstraňovaniu výkalov a odpadkov a tiež po­travinám konzumovaným v surovom stave. V prípade rodi­ny bolo nutné nainštalovať k zdroju vody (studni) filtrovací systém, ktorý v budúcnosti vylúči riziko vzniku podobnej in­fekcie. Je vhodné upozorniť ošetrujúcich lekárov aj v kraji­nách s miernym podnebím, ako je Slovenská republika, na riziko výskytu infekcií spôsobených Vibrio cholerae a ostat­ných druhov Vibrio spp. a v prípade gastroenteritíd (napr. po konzumácii vody zo studne) žiadať analýzu prítomnosti tých­to baktérií v biologickej vzorke. Vďaka moderným metódam identifikácie patogénnych mikroorganizmov vo vzorkách, napr. pomocou hmotnostnej spektrometrie MALDI-TOF, sa diagnostika črevných nákaz v posledných rokoch v laborató­riách Medirex, a. s., výrazne skvalitňuje.

Záver

Predložená kazuistika pacientky bola prvým potvrdeným prípadom infekcie V. cholerae non-O1, non-O139 v našom re­gióne aj na Slovensku. Prípad potvrdzuje potrebu promptnej a kvalitnej diagnostiky týchto infekcií v laboratóriách klinickej mikrobiológie a neustále zvyšovanie erudovanosti klinických mikrobiológov. Je tiež dôležité zvýšiť povedomie a informo­vať o možnosti výskytu takýchto ochorení na Slovensku aj odbornú lekársku verejnosť. Identifikácia vibrií izolovaných z klinických materiálov by mala byť vždy potvrdená v NRC pre Vibrionaceae pri RÚVZ v Komárne, ktoré rovnako v prí­pade výskytu V. cholerae vykonáva dôkaz príslušnosti k séroskupinám s vysokým potenciálom epidemického výskytu a dôkaz produkcie cholerového toxínu. NRC tieto vyšetrenia vykonáva s pôsobnosťou pre celú SR.

Poďakovanie

Táto práca bola čiastočne vytvorená realizáciou projek­tu Centrum excelentnosti environmentálneho zdravia, ITMS č. 26240120033, na základe podpory operačného projektu Výskum a vývoj, financovaného z Európskeho fondu regioná­lneho rozvoja.

LITERATÚRA

1. Engel MF, Muijsken MA, Mooi-Kokenberg E, et al. Vibrio cholerae non-O1 bacteraemia: description of three cases in the Netherlands and a literature review. 2016.
2. Versalovic J, Carroll KC, Funke G, et al. Manual of clinical microbiolo­gy. Washington, DC: ASM Press; 2011.
3. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). CDC Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae. Ch 6. Atlanta: CDC. [Accessed 13 Apr 2016]. Available from: http://www.cdc.gov/cholera/pdf/Laboratory-Meth- ods-for-the-Diagnosis-of-Vibrio-cholerae-chapter-6.pdf
4. Ou TY, Liu JW, Leu HS. Independent prognostic factors for fatality in patients with invasive Vibrio cholera non-O1 infections. J Microbiol Immu­nol Infect 2003; 36: 117-122.
5. Leibovici-Weissman Y, Neuberger A, Bitterman R, et al. Antimicro­bial drugs for treating cholera. Cochrane Database Sys Rev 2014; 6: CD008625.
6. Deshayes S, Daurel C, Cattoir V, et al. Non-O1, non-O139 Vibrio chol­erae bacteraemia: case report and literature review. Springerolus 2015; 4: 575.