*Všetky tabuľky, grafy a obrázky, ktoré sú súčasťou článku, nájdete v priloženom PDF súbore na konci štúdie.
Úvod
Glykozylácia je esenciálna modifikácia proteínov, ktorá zásadne ovplyvňuje ich funkciu, stabilitu, aktivitu a mnohé iné vlastnosti. Na rozdiel od transkripcie a translácie je to netemplátový proces, katalyzovaný stovkami rôznych enzýmov a transportérov, prebiehajúci v endoplazmatickom retikule, Golgiho aparáte a cytozole. Dnes je známe, že porucha homeostázy organizmu môže negatívne ovplyvniť súhru týchto glykozylačných metabolických kaskád. Aberantná glykozylácia bola pozorovaná pri rôznych onkologických, neurodegeneratívnych, autoimunitných a iných ochoreniach(1-3) pravdepodobne ako sekundárny jav; ale takisto pri kongenitálnych poruchách glykozylácie (CDG), ktoré sú primárne spôsobené mutáciou génov komplexnej glykozylačnej dráhy.
Pôvodne sa skupina CDG delila na dva typy (typ I a II) podľa profilu IEF transferínu (Tf), pričom do skupiny CDG I patrili defekty spôsobené pri syntéze N-glykánov vzniknuté v cytozole alebo v endoplazmatickom retikule a do CDG II defekty vzniknuté v Golgiho aparáte pri úprave glykánov. Toto rozde-lenie zahŕňalo len poruchy N-glykozylácie. Vzhľadom na narastajúci počet ochorení a neustále odhaľovanie nových porúch v dráhach glykozylácie bolo nutné po opísaní viac ako 40 ochorení v roku 2009 klasifikáciu aj nomenklatúru zmeniť. Na označenie ochorenia sa v súčasnosti používa názov mutova-ného génu spolu so skratkou CDG. V súčasnosti je známych viac ako 160 rôznych porúch glykozylácie. Nová klasifikácia rozdeľuje celú skupinu na: (a) poruchy N-glykozylácie proteí-nov, (b) poruchy O-glykozylácie proteínov, (c) poruchy syntézy glykozylfosfatidylinozitolovej kotvy a glykolipidov, (d) poruchy viacerých dráh glykozylácie a poruchy ostatných dráh.
Biochemickým skríningom N-glykozylačných, O-glykozylačných a zmiešaných porúch a porúch syntézy dolicholu je IEF Tf, apolipoproteínu C-III zo séra a vyšetrenie profilu dolicholov v moči.
Klinické príznaky CDG často zahŕňajú multiorgánové postihnutie. Medzi častými nálezmi sú polystigmatizácia, poruchy rastu, psychomotorická retardácia, poruchy imunity, hypotónia, záchvaty a muskuloskeletové abnormality. Klinické manifestácie takmer u všetkých CDG pacientov sa objavujú už v dojčenskom veku(4). Biochemické parametre zahŕňajú koagulopatie a zvýšené hladiny pečeňových transamináz. V prípade PMM2-CDG, subtypu s celosvetovo najvyššou frekvenciou výskytu heterogenita klinických prejavov zahŕňa skorú neonatálnu mortalitu až po dosiahnutie normálnej do-spelosti(5). Korelácie medzi genotypom a fenotypom sú u jednotlivých pacientov veľmi variabilné, čo spolu s nešpecifickými klinickými príznakmi zaraďuje tieto ochorenia medzi ťažko diagnostikovateľné.
Materiál a metóda
V roku 2012 bol v Centre dedičných metabolických porúch (CDMP) NÚDCH zavedený selektívny skríning CDG založený na metóde izoelektrickej fokusácie (IEF) sérového transferínu. Za obdobie rokov 2012 – 2020 bolo celkovo analyzo vaných 3 600 vzoriek pacientov so suspektným podozrením na CDG odoslaných z metabolických ambulancií a klinických pracovísk v rámci celého Slovenska. Princíp IEF Tf spočíva v separácii izoforiem transferínu (biomarkera nesúceho dve N-glykozylačné miesta) na základe ich izoelektrického bodu s následnou imunodetekciou a denzitometrickou kvantifikáciou. Metóda umožňuje rozlíšiť poruchu glykozylácie v syntéze oligosacharidického prekurzora v endoplazmatickom retikule (CDG typ I) od poruchy v procesovaní glykánov (CDG typ II), ktoré prebieha v Golgiho aparáte. Táto metóda je veľ-mi spoľahlivá, reprodukovateľná a predstavuje celosvetovo tzv. zlatý štandard pre CDG diagnostiku, nedokáže však určiť konkrétne miesto prerušenia glykozylačnej metabolickej dráhy. Odhaduje sa, že až 40 % zachytených CDG pacientov stále nemá potvrdenú presnú molekulárnu podstatu(6). Diagnostika týchto zriedkavých ochorení vyžaduje personalizovaný prístup, kde nachádza svoje uplatnenie spolupráca klinických diagnostikov s vedeckými laboratóriami.
Chemický ústav Slovenskej akadémie vied sa vďaka boha-tým skúsenostiam v oblasti štruktúrnej analýzy glykokonjugátov zapojil do regionálnej (CDMP NÚDCH) i medzinárodnej spolupráce (v rámci CDG & ALLIES – PPAIN siete). Zavedený štandardný operačný protokol analýzy N-glykoprofilu využíva 10 mikrolitrov krvného séra alebo približne 100 mikrogramov imunoafinitne izolovaného glykobiomarkera (napr. Tf). Glykány sú enzymaticky odštiepené a separované od proteínov prostredníctvom „solidphase extrakcie“. S cieľom zvýšenia intenzít signálov v následne nameraných MALDI TOF hmotnostných spektrách (MS) sa vzorky derivatizujú permetyláciou. V prípade potreby kvantifikácie jednotlivých štruktúr sa využíva vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) v kombinácii s MS. Reprezentatívny glykoprofil Tf získaný zo vzorky negatívnej kontroly metódami tradičného selektívneho skríningu, HPLC a MS je znázornený na obrázku 1. Pri podozrení na poruchu glykozylácie prvého typu (CDG I) je vhodná analýza neutrálnej frakcie N-glykánov prostredníctvom MALDI TOF MS a pri podozrení na CDG II je, naopak, naj-vhodnejším prístupom analýza sialylovaných glykánov, kde možno pozorovať prípadné defekty v konečnom procesovaní glykánov už naviazaných na vznikajúci proteín.
Výsledky a diskusia
V predloženej práci prezentujeme dvoch vybraných slo-venských pacientov, ktorým bola diagnostikovaná CDG s nasledujúcou skrátenou epikrízou:
Pacient I – novorodenec, respiračná insuficiencia, hy-poglykémia, trombocytopénia, hypokolaguačný stav, skele-tové abnormality, nefropatia, hepatopatia, opakujúce sa res-piračné infekcie. IEF Tf poukázala na CDG typu I. Pacient exitoval vo veku 164 dní. Sekvenovaním klinického exómu bola potvrdená homozygotná mutácia v géne ALG12, kódujúceho esenciálny enzým zúčastňujúci sa na výstavbe oligo-sacharidického prekurzora v endoplazmatickom retikule(7).
Pacient II – vek v čase stanovenia diagnózy 12 rokov; k dnešnému dňu v dobrom klinickom stave; pretrvávajúci hypokoagulačný stav, mierne zvýšené hladiny AST, ALT, hypocholesterolémia, hypobetalipoproteinémia. IEF Tf poukáza-la na CDG typu II. Na základe exómového sekvenovania bola u pacienta potvrdená de novo mutácia v géne SLC37A4, zod-povedná za mislokalizáciu glukóza-6-fosfátového transportéra(8).
U prezentovaných CDG I aj II pacientov bola na základe pozitívneho výsledku zo selektívneho skríningu vykonaná analýza sérových N-glykánov prostredníctvom MALDI TOF MS. V prípade pacienta I boli pozorované znížené hladiny GlcNAc-2Man8-9 (m/z 2192.2 a 2396.3). Hladina GlcNAc2Man9Glc1 (m/z 2600.6) bola u pacienta I nedetegovateľná. V prípade pacienta II boli pozorované signifikantne zvýšené hladiny „hybridných“ štruktúr Hex6GlcNAc3NeuAc1 (m/z 2390.2), Hex5GlcNAc3NeuAc1 (m/z 2186.1), a Hex4GlcNAc3Neu-Ac1 (m/z 1982.0). Reprezentatívne spektrá porovnané s negatívnymi kontrolami, napovedajúce o primárnej poruche v glykozylácii, sú znázornené na obrázku 2. (GlcNAc – N-ace-tylglukozamín, Man – manóza, Glc – glukóza, NeuAc – kys. sialová).
U pacienta I signifikantný pokles hladín GlcNAc2Man8-9 vo frakcii neutrálnych sérových N-glykánov poukázal na zníženú aktivitu α-manozyltransferázy 8, kódovanej génom ALG12. Tento enzým katalyzuje pridanie ôsmeho manózové ho zvyšku na vznikajúci oligosacharid, viazaný prostredníc-tvom lipidového nosiča na membránu endoplazmatického retikula. Analýza klinického exómu prostredníctvom Clinical Exome Solution panelu sekvenovania novej generácie (z an-gl. „next generation sequencing“, NGS) identifikovala homo-zygotný variant c.1439T>C p.(Leu480Pro) v exóne 10 génu ALG12. K dnešnému dňu bolo celosvetovo identifikovaných iba 16 pacientov s týmto ochorením.
Poruchy glykozylácie druhého typu sú veľkou výzvou pre diagnostiku, pretože aberantný glykoprofil často nepoukazuje na konkrétny defekt v glykozylačnej kaskáde. Prezentované výsledky z analýzy sérových N-glykánov pacienta II, ktorého molekulárna podstata bola objasnená na zahranič-nom pracovisku(8), však na základe akumulácie aberantných hybridných štruktúr poukazujú na primárnu poruchu v glykozylácii. NGS analýza exómu poukázala na de novo mutáciu c.1267C > T (R423*) v géne SLC37A4 kódujúcom transportér glukózo6fosfátu(8). Na základe literatúry strata funkcie trans-portéra glukózo-6-fosfátu vedie k lyzozómovej poruche s názvom „Glycogen storage disorder (GSD)“ typu Ib(9), ale špecifická mutácia v tomto géne môže viesť aj k intracelulárnej mislokalizácii tohto transportéra s úplne odlišnou klinickou manifestáciou(8).
Hmotnostná spektrometria predstavuje významný prínos v diagnostike CDG prvého aj druhého typu a môže byť štandardne zavedená ako nasledujúci krok, nadväzujúci na pozitívny, respektíve hraničný výsledok selektívneho skríningu. Štruktúrna analýza predstavuje esenciálnu súčasť personalizovanej diagnostiky a aj vďaka svojej nižšej finančnej a časovej náročnosti by mala predchádzať molekulárnogenetickým analýzam (NGS). Odhaduje sa však, že pre technologickú ná-ročnosť personalizovanej diagnostiky a širokú heterogenitu klinických príznakov celosvetovo stále ostáva mnoho CDG pacientov poddiagnostikovaných. Zvýšenie povedomia laickej i odbornej verejnosti o týchto ochoreniach a spolupráca klinických a vedeckých pracovísk však môže významne prispieť k včasnému a spoľahlivému určeniu diagnózy, čo môže mať aj výrazný vplyv na kvalitu života pacientov a ich rodín.
Záver
V diagnostike zriedkavých ochorení nachádza spolupráca medzi vedeckými inštitúciami a diagnostickými pracoviskami veľké uplatnenie. Pokročilé analytické metódy ako hmotnostná spektrometria a kvapalinová chromatografia môžu byť napriek svojej technickej náročnosti optimalizované a automatizované do vysokopriepustných formátov a rozšíriť tak možnosti tzv. personalizovanej diagnostiky s individuálnym prístupom ku každému pacientovi. Práve dôkladná korelácia výsledkov štruktúrnej analýzy biomarkerov a klinických, biochemických a genetických vyšetrení môže pomôcť objasniť molekulárnu podstatu týchto raritných ochorení.
Konflikt záujmov
Autori deklarujú, že nemajú žiadny konflikt záujmov a zároveň čestne vyhlasujú, že práca nebola publikovaná v inom periodiku.
Poďakovanie
Táto práca bola podporená Ministerstvom zdravotníctva SR v rámci projektu s registračným číslom 2019/7-CHÚSAV-4, grantom č. 2/0060/21 Slovenskej grantovej agentúry pre vedu VEGA. Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná štruktúra pre projekt: Štúdium štruktúrnych zmien komplexných glykokonjugátov v procese dedičných metabolických a civilizačných ochorení, ITMS: 313021Y920, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja a MZ ČR-RVO-VFN64165 Autori tohto článku sú členmi Európskej referenčnej siete pre zriedkavé metabolické poruchy (European Reference Network for Rare Hereditary Metabolic Disorders, MetabERN – Project ID No 739543).
LITERATÚRA
1. Moffett S, Shiao TC, Mousavifar L, et al. Aberrant glycosylation patterns on cancer cells: Therapeutic opportunities for glycodendrimers/metallodendrimers oncology. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology 2021;13(1):e1659.
2. Shafi S, Singh A, Gupta P, et al. Deciphering the Role of Aberrant Protein Post-Translational Modification in the Pathology of Neurodegeneration. CNS Neurol Disord – Drug Targets 2021;20(1):54–67.
3. Kennedy PGE, Graner M, Pointon T, et al. Aberrant Immunoglobulin G Glycosylation in Multiple Sclerosis J Neuroimmune Pharmacol. Publikované online 03. máj 2021. doi:10.1007/s11481-021-09996-1
4. Lekka DE, Brucknerova J, Salingova A, et al. Congenital disorders of glycosylation – an umbrella term for rapidly expanding group of rare genetic metabolic disorders – importance of physical investigation. Bratislava Med J 2021;122(03):190–195.
5. Morena‐Barrio ME, Sabater M, Morena‐Barrio B, et al. ALG12‐CDG: An unusual patient without intellectual disability and facial dysmorphism, and with a novel variant. Mol Genet Genomic Med 2020;8(8):e1304.
6. Jones MA, Bhide S, Chin E, et al. Targeted polymerase chain reaction-based enrichment and next generation sequencing for diagnostic testing of congenital disorders of glycosylation. Genet Med 2011;13(11):921–932.
7. Ziburová J, Nemčovič M, Šesták S, et al. A novel homozygous mutation in the human ALG12 gene results in an aberrant profile of oligomannose N-glycans in patient’s serum. Am J Med Genet Part A 2021;185(11):3494–3501.
8. Marquardt T, Bzduch V, Hogrebe M, et al. SLC37A4-CDG: Mislocal-ization of the glucose-6-phosphate transporter to the Golgi causes a new congenital disorder of glycosylation. Mol Genet Metab Reports 2020;25:100636.
9. Chou JY, Jun HS, Mansfield BC. Type I glycogen storage diseases: disorders of the glucose-6-phosphatase/glucose-6-phosphate transporter complexes. J Inherit Metab Dis 2015;38(3):511–519.
